การหมุนเหวี่ยงในเซลล์วิทยา การหมุนเหวี่ยงเซลล์แบบเศษส่วน

Leibig (Zig. ตาม S. Granik, 1962) พบว่าเหล็กในเนื้อเยื่อเกี่ยวกับเนื้อเยื่อเจริญมีความจำเป็นสำหรับการสังเคราะห์เอนไซม์ที่มีธาตุเหล็กของไมโตคอนเดรีย 82% มีความเข้มข้นในคลอโรพลาสต์ พบเพียงร่องรอยในนิวเคลียส ขณะเดียวกัน A.F. อากาโฟโนวา, N.S. Chaplygina (1962) ศึกษาการดูดซึมธาตุเหล็กจากพืชและการกระจายตัวของธาตุเหล็กภายในเซลล์ สรุปว่านิวเคลียสของเซลล์ของเนื้อเยื่อใบข้าวโพดมีธาตุเหล็กมากกว่าโครงสร้างประเภทคลอโรพลาสต์และไมโตคอนเดรีย ปริมาณธาตุเหล็กในระยะหลังต่ำกว่าในคลอโรพลาสต์
งานของ J. Skok (1962) ให้ข้อมูลบางส่วนเกี่ยวกับตำแหน่งของโบรอนในโครงสร้างเซลล์ ผู้เขียนชี้ให้เห็นว่าไมโตคอนเดรียและไมโครโซมมีโบรอนน้อยกว่านิวเคลียส พลาสติด และส่วนลอยเหนือตะกอน ในการทำหน้าที่ต่างๆ ของเซลล์ โบรอนที่มีอยู่ในเศษส่วนที่ถูกฟอกของส่วนลอยเหนือตะกอนจะถูกใช้
เราร่วมกับ Z.M. Klimovitskaya, L.D. Leydenskaya และ E.V. รูดาโควาในปี 2504-2496 ศึกษาตำแหน่งของธาตุรองแมงกานีส โมลิบดีนัม และสังกะสีในโครงสร้างเซลล์ของพืช รวมถึงเนื้อหาของธาตุรองที่เกี่ยวข้องกับการสร้างเซลล์ของพืช ใช้วิธีการหมุนเหวี่ยงที่แตกต่างกันซึ่งทำให้สามารถแยกไซโตพลาสซึมและออร์แกเนลล์ของเซลล์: นิวเคลียส, คลอโรพลาสต์, ไมโตคอนเดรีย เราปฏิบัติตามวิธีการแยกโครงสร้างเซลล์ที่เสนอโดย N.S. ซิสซาเคียน ไอ.เอ็ม. โมโซโลวา (2504-2505)
ในปีพ.ศ. 2504 งานได้ดำเนินการในเครื่องหมุนเหวี่ยงแบบแช่เย็นด้วยความละเอียดรวม 30,000 กรัม ชิ้นส่วนเซลล์ขนาดใหญ่ถูกแยกออกจากเนื้อเดียวกันของใบซูการ์บีท (พันธุ์ Verkhnyachskaya 020) ในสารละลายซูโครส 0.35 โมลาร์ ที่ 2,500 กรัม คลอโรพลาสต์ ที่ 4,500 กรัม และไมโตคอนเดรีย ที่ 17,000 กรัม เศษส่วนที่แยกจากกันถูกเผา แมงกานีสถูกกำหนดไว้ในเถ้าที่เกิดขึ้น เนื้อหาแสดงเป็นมิลลิกรัมในรูปของเศษส่วนเฉพาะที่แยกได้จากพืชดิบ 1 กิโลกรัม ดังนั้นชิ้นส่วนเซลล์ขนาดใหญ่จึงมีแมงกานีส 20.88 มก./กก. หรือ 44.5% ในคลอโรพลาสต์ - 3.46 หรือ 7.5; ในไมโตคอนเดรีย - 2.05 หรือ 4.3; ในโครงสร้างไซโตพลาสซึมที่ไม่ใช่สีเขียว - 20.43 มก. / กก. หรือ 43.7% การเตรียมคลอโรพลาสต์ถูกระบุโดยการเรืองแสงที่มีลักษณะเฉพาะ
ปริมาณแมงกานีสสูงสุดมีอยู่ในโครงสร้างไซโตพลาสซึมที่ไม่ใช่สีเขียวและชิ้นส่วนของเซลล์ขนาดใหญ่ เมื่อคำนวณปริมาณแมงกานีสใหม่ในเถ้าของแต่ละเศษส่วน ปริมาณสูงสุดของแมงกานีสจะถูกบันทึกไว้สำหรับเศษส่วนคลอโรพลาสต์และไมโตคอนเดรีย ชิ้นส่วนเซลล์ขนาดใหญ่มีแมงกานีส 325.1 มก. ต่อเถ้า 100 กรัม หรือ 16.3% ในคลอโรพลาสต์ - 823.9 หรือ 42.5; ในไมโตคอนเดรีย - 500 หรือ 25.1; ในโครงสร้างไซโตพลาสซึมที่ไม่ใช่สีเขียว - 321 มก. หรือ 16.1% แมงกานีส
ในปี 1962 เราได้นำวิธีการต่อไปนี้มาใช้ในการศึกษาเนื้อหาของแมงกานีส โมลิบดีนัม และสังกะสีในโครงสร้างเซลล์ของใบถั่วฟาบาและหัวบีท ถั่ว (พันธุ์ Herz-Freya) และหัวบีท (พันธุ์ Ramonskaya 04) ปลูกที่สถานีฟาร์มทดลองของสถาบันสรีรวิทยาพืชของ Academy of Sciences ของ SSR ของยูเครนบนดินพอดโซไลซ์แบบทุ่งหญ้า - เชอร์โนเซมตามพื้นหลัง NPK ด้วย การเติมแมงกานีส โมลิบดีนัม และสังกะสี ในตอนต้น กลาง และปลายฤดูปลูก เราได้เก็บตัวอย่างใบไม้ (วัตถุดิบ 30 กรัม) จากนั้นนำมาบดบนน้ำแข็งที่มีซูโครส 0.5 โมลาร์ 40 มล. และบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 10 มล. (ตามข้อมูลของ Sørensen); pH ของสิ่งแวดล้อมคือ 7.1 โฮโมจีเนตที่เป็นผลลัพธ์ถูกนำไปปั่นแยกแบบดิฟเฟอเรนเชียลบนเครื่องหมุนเหวี่ยง TM-14 ที่มีความละเอียด 20,000 กรัม ขั้นแรก ชิ้นส่วนของเซลล์ขนาดใหญ่ถูกเอาออกจากโฮโมจีเนต จากนั้น ชิ้นส่วนเล็ก ๆ (ชิ้นส่วน) ของเซลล์ถูกแยกออกในเครื่องปั่นแยกที่ 1,500 และ 3,000 กรัม เป็นเวลา 10 นาที สังเกตว่าที่ 3,000 กรัม นิวเคลียสจะจับตัวภายใน 10 นาที คลอโรพลาสต์ถูกแยกเป็นเวลา 15 นาทีที่ 6,000 - 10,000 กรัม และไมโตคอนเดรียถูกแยกได้ที่ 14,000 กรัม เศษส่วนที่แยกได้จะถูกปั่นเหวี่ยงซ้ำด้วยซูโครส 2 มิลลิลิตรเป็นเวลา 10-15 นาทีด้วยความเร็วที่เหมาะสมสำหรับแต่ละเศษส่วน เศษส่วนที่เกิดขึ้นจะถูกเผาด้วยการเผาและระบุแมงกานีส โมลิบดีนัม และสังกะสีในเถ้าของพวกเขา เนื้อหาขององค์ประกอบย่อยเหล่านี้ยังถูกกำหนดในส่วนลอยเหนือตะกอนที่เหลืออยู่อีกด้วย
เศษส่วนได้รับการวิเคราะห์ทางเนื้อเยื่อวิทยา ตรวจสอบเยื่อหุ้มเซลล์ นิวเคลียส และคลอโรพลาสต์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ เราไม่สามารถระบุไมโตคอนเดรียได้ ใบถั่วมีองค์ประกอบที่มีรูปร่างหนักมาก สิ่งเหล่านี้ส่วนใหญ่เป็นคลอโรพลาสต์ซึ่งมีการตกตะกอนเกือบทั้งหมดที่ 3,000-6,000 กรัม ของเหลวเหนือตะกอนมีความชัดเจน ในซูการ์บีต คลอโรพลาสต์จะถูกตะกอนดีที่สุดที่ 6,000-10,000 กรัม ไม่สามารถได้ส่วนลอยเหนือตะกอนที่โปร่งใสโดยสมบูรณ์แม้จะอยู่ที่ 14,000 กรัมก็ตาม สิ่งนี้อธิบายได้อย่างชัดเจนถึงการขาดวิธีการแบบครบวงจรในการแยกโครงสร้างเซลล์ ระดับการตกตะกอนของโครงสร้างเซลล์ที่แตกต่างกันต้องใช้วิธีการแยกที่แตกต่างกัน โดยคำนึงถึงลักษณะทางชีวภาพของแต่ละวัฒนธรรม
ปริมาณขององค์ประกอบย่อยในโครงสร้างเซลล์ที่แยกได้โดยการหมุนเหวี่ยงแบบดิฟเฟอเรนเชียลคำนวณเป็นมิลลิกรัมต่อวัตถุดิบ 1 กิโลกรัมของตัวอย่าง โดยคิดเป็นเปอร์เซ็นต์ของปริมาณทั้งหมดและเป็นมิลลิกรัมต่อเถ้า 100 กรัมของแต่ละเศษส่วน
จากโครงสร้างเซลล์ของใบชูการ์บีท ปริมาณแมงกานีสสูงสุด (เมื่อคำนวณต่อเศษส่วนที่แยกได้จากวัตถุดิบ 1 กิโลกรัม) จะเข้มข้นในของเหลวเหนือตะกอน เช่น ในไซโตพลาสซึม ในชิ้นส่วนเซลล์ขนาดใหญ่ (คลอโรพลาสต์, นิวเคลียส, ไมโตคอนเดรีย) จะบรรจุอยู่ในลำดับจากมากไปน้อย ในช่วงกลางฤดูปลูกปริมาณแมงกานีสในใบบีทรูท (ตารางที่ 45) จะเพิ่มขึ้นเนื่องจากการเพิ่มขึ้นของเนื้อหาในชิ้นส่วนเซลล์ขนาดใหญ่และของเหลวเหนือตะกอน ในออร์แกเนลล์ของเซลล์ (นิวเคลียส คลอโรพลาสต์ ไมโตคอนเดรีย) จะยังคงค่อนข้างคงที่ตลอดฤดูปลูก

การหมุนเหวี่ยงคืออะไร? ใช้วิธีอะไร? คำว่า "การหมุนเหวี่ยง" หมายถึงการแยกอนุภาคของเหลวหรือของแข็งของสารออกเป็นเศษส่วนต่างๆ โดยใช้แรงเหวี่ยง การแยกสารนี้ดำเนินการผ่านการใช้อุปกรณ์พิเศษ - เครื่องหมุนเหวี่ยง หลักการของวิธีการคืออะไร?

หลักการหมุนเหวี่ยง

ลองดูคำจำกัดความโดยละเอียดเพิ่มเติม การหมุนเหวี่ยงเป็นผลต่อสารต่างๆ ผ่านการหมุนด้วยความเร็วสูงพิเศษในอุปกรณ์เฉพาะทาง ส่วนหลักของเครื่องหมุนเหวี่ยงคือโรเตอร์ซึ่งมีรังสำหรับติดตั้งหลอดทดลองด้วยวัสดุที่อาจแยกออกเป็นเศษส่วนแยกกัน เมื่อโรเตอร์หมุนด้วยความเร็วสูง สารที่วางอยู่ในหลอดทดลองจะถูกแยกออกเป็นสารต่างๆ ตามระดับความหนาแน่น ตัวอย่างเช่น การหมุนเหวี่ยงตัวอย่างน้ำใต้ดินจะแยกของเหลวและตกตะกอนอนุภาคของแข็งที่บรรจุอยู่ในนั้น

ผู้เขียนวิธีการ

เป็นครั้งแรกที่ทราบว่าการหมุนเหวี่ยงคืออะไรหลังจากการทดลองโดยนักวิทยาศาสตร์ A.F. Lebedev วิธีนี้ได้รับการพัฒนาโดยนักวิจัยเพื่อตรวจสอบองค์ประกอบของน้ำในดิน ก่อนหน้านี้ เพื่อวัตถุประสงค์เหล่านี้ มีการใช้การตกตะกอนของของเหลวตามด้วยการแยกตัวอย่างของแข็งออกจากของเหลว การพัฒนาวิธีการหมุนเหวี่ยงทำให้สามารถรับมือกับงานนี้ได้เร็วขึ้นมาก ด้วยการแยกสารนี้ ทำให้สามารถแยกส่วนที่เป็นของแข็งของสารออกจากของเหลวในรูปแบบแห้งได้ภายในเวลาไม่กี่นาที

ขั้นตอนการหมุนเหวี่ยง

การปั่นแยกแบบดิฟเฟอเรนเชียลเริ่มต้นด้วยการตกตะกอนของสารที่ต้องได้รับการวิจัย การประมวลผลวัสดุนี้เกิดขึ้นในอุปกรณ์ตกตะกอน ในระหว่างการตกตะกอน อนุภาคของสสารจะถูกแยกออกจากกันภายใต้อิทธิพลของแรงโน้มถ่วง ซึ่งช่วยให้คุณเตรียมสารเพื่อการแยกสารได้ดีขึ้นโดยใช้แรงเหวี่ยง

จากนั้นจึงทำการกรองสารในหลอดทดลอง ในขั้นตอนนี้มีการใช้ถังแบบมีรูพรุนซึ่งมีจุดประสงค์เพื่อแยกอนุภาคของเหลวออกจากของแข็ง ในระหว่างกิจกรรมที่นำเสนอ ตะกอนทั้งหมดยังคงอยู่บนผนังของเครื่องหมุนเหวี่ยง

ข้อดีของวิธีการ

เมื่อเปรียบเทียบกับวิธีการอื่นๆ ที่มุ่งแยกสารแต่ละชนิด เช่น การกรองหรือการตกตะกอน การปั่นเหวี่ยงทำให้ได้ตะกอนที่มีปริมาณความชื้นน้อยที่สุด การใช้วิธีการแยกนี้ทำให้สามารถแยกสารแขวนลอยที่ละเอียดได้ ผลลัพธ์ที่ได้คือการผลิตอนุภาคที่มีขนาด 5-10 ไมครอน ข้อดีที่สำคัญอีกประการหนึ่งของการหมุนเหวี่ยงคือความสามารถในการดำเนินการโดยใช้อุปกรณ์ที่มีปริมาตรและขนาดน้อย ข้อเสียเปรียบเพียงประการเดียวของวิธีนี้คืออุปกรณ์ใช้พลังงานสูง

การหมุนเหวี่ยงในชีววิทยา

ในทางชีววิทยา การแยกสารออกเป็นสารแต่ละชนิดจะใช้เมื่อจำเป็นต้องเตรียมการเตรียมการสำหรับการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ การหมุนเหวี่ยงที่นี่ดำเนินการโดยใช้อุปกรณ์ที่ซับซ้อน - ไซโตโรเตอร์ นอกจากช่องสำหรับหลอดทดลองแล้ว อุปกรณ์ดังกล่าวยังมีที่ยึดตัวอย่างและสไลด์ทุกประเภทที่มีการออกแบบที่ซับซ้อน การออกแบบเครื่องหมุนเหวี่ยงเมื่อทำการวิจัยทางชีววิทยาส่งผลโดยตรงต่อคุณภาพของวัสดุที่ได้รับและตามปริมาณข้อมูลที่เป็นประโยชน์ที่สามารถรวบรวมได้จากผลการวิเคราะห์

การหมุนเหวี่ยงในอุตสาหกรรมการกลั่นน้ำมัน

วิธีการปั่นเหวี่ยงเป็นสิ่งที่ขาดไม่ได้ในการผลิตน้ำมัน มีแร่ธาตุไฮโดรคาร์บอนซึ่งน้ำไม่ได้ถูกปล่อยออกมาอย่างสมบูรณ์ระหว่างการกลั่น การหมุนเหวี่ยงทำให้สามารถกำจัดของเหลวส่วนเกินออกจากน้ำมันได้ และเพิ่มคุณภาพ ในกรณีนี้ น้ำมันจะถูกละลายในเบนซีน จากนั้นให้ความร้อนที่ 60 o C จากนั้นจึงใช้แรงเหวี่ยงหนีศูนย์ สุดท้าย ให้วัดปริมาณน้ำที่เหลืออยู่ในสารและทำซ้ำขั้นตอนนี้หากจำเป็น

การปั่นแยกเลือด

วิธีนี้ใช้กันอย่างแพร่หลายเพื่อวัตถุประสงค์ในการรักษาโรค ในทางการแพทย์ จะช่วยแก้ปัญหาต่างๆ ดังต่อไปนี้:

การรับตัวอย่างเลือดบริสุทธิ์เพื่อทำพลาสมาฟีเรซิส เพื่อจุดประสงค์เหล่านี้ องค์ประกอบที่เกิดขึ้นของเลือดจะถูกแยกออกจากพลาสมาด้วยเครื่องหมุนเหวี่ยง การผ่าตัดทำให้สามารถกำจัดไวรัสในเลือด แอนติบอดีส่วนเกิน แบคทีเรียที่ทำให้เกิดโรค และสารพิษได้
การเตรียมเลือดสำหรับการถ่ายเลือดของผู้บริจาค หลังจากที่ของเหลวในร่างกายถูกแยกออกเป็นเศษส่วนแยกกันโดยการปั่นแยก เซลล์เม็ดเลือดจะถูกส่งกลับไปยังผู้บริจาค และใช้พลาสมาสำหรับการถ่ายเลือดหรือแช่แข็งเพื่อใช้ในภายหลัง
การแยกมวลเกล็ดเลือด สารนี้ได้มาจากมวลที่เกิดขึ้นและใช้ในแผนกศัลยกรรมและโลหิตวิทยาของสถาบันการแพทย์ ในการรักษาฉุกเฉิน และห้องผ่าตัด การใช้มวลเกล็ดเลือดในทางการแพทย์ทำให้การแข็งตัวของเลือดในผู้ป่วยดีขึ้นได้
การสังเคราะห์เซลล์เม็ดเลือดแดง การหมุนเหวี่ยงของเซลล์เม็ดเลือดเกิดขึ้นโดยการแยกเศษส่วนอย่างละเอียดอ่อนตามเทคนิคพิเศษ มวลที่เสร็จแล้วซึ่งอุดมไปด้วยเซลล์เม็ดเลือดแดงนั้นใช้สำหรับการถ่ายเลือดระหว่างการสูญเสียเลือดและการผ่าตัด เซลล์เม็ดเลือดแดงมักใช้รักษาโรคโลหิตจางและโรคระบบเลือดอื่นๆ

ในการปฏิบัติทางการแพทย์สมัยใหม่มีการใช้อุปกรณ์รุ่นใหม่จำนวนมากซึ่งทำให้สามารถเร่งถังหมุนด้วยความเร็วที่แน่นอนและหยุดในช่วงเวลาหนึ่งได้ ช่วยให้แยกเลือดออกเป็นเซลล์เม็ดเลือดแดง เกล็ดเลือด พลาสมา ซีรั่ม และลิ่มเลือดได้แม่นยำยิ่งขึ้น การตรวจของเหลวในร่างกายอื่นๆ ก็ทำเช่นเดียวกัน โดยเฉพาะการแยกสารในปัสสาวะ

เครื่องหมุนเหวี่ยง: ประเภทหลัก

เราหาได้ว่าการหมุนเหวี่ยงคืออะไร ตอนนี้เรามาดูกันว่าอุปกรณ์ใดบ้างที่ใช้ในการนำวิธีนี้ไปใช้ เครื่องปั่นแยกสามารถปิดหรือเปิดได้ โดยขับเคลื่อนด้วยกลไกหรือด้วยตนเอง ส่วนการทำงานหลักของเครื่องมือเปิดแบบมือถือคือแกนหมุนที่อยู่ในแนวตั้ง ในส่วนบนจะมีแถบยึดตั้งฉากซึ่งมีปลอกโลหะแบบเคลื่อนย้ายได้ ประกอบด้วยหลอดทดลองพิเศษที่แคบลงที่ด้านล่าง วางสำลีไว้ที่ด้านล่างของปลอก เพื่อหลีกเลี่ยงความเสียหายต่อหลอดทดลองที่เป็นแก้วเมื่อสัมผัสกับโลหะ จากนั้นอุปกรณ์ก็เริ่มทำงาน หลังจากนั้นครู่หนึ่ง ของเหลวจะแยกออกจากของแข็งแขวนลอย หลังจากนั้น เครื่องหมุนเหวี่ยงแบบแมนนวลจะหยุดทำงาน ตะกอนแข็งที่หนาแน่นจะกระจุกตัวอยู่ที่ด้านล่างของหลอดทดลอง ด้านบนเป็นส่วนที่เป็นของเหลวของสาร

เครื่องหมุนเหวี่ยงเชิงกลชนิดปิดมีปลอกจำนวนมากเพื่อรองรับหลอดทดลอง อุปกรณ์ดังกล่าวสะดวกกว่าอุปกรณ์แบบแมนนวล โรเตอร์ของพวกเขาขับเคลื่อนด้วยมอเตอร์ไฟฟ้าที่ทรงพลังและสามารถเร่งความเร็วได้ถึง 3,000 รอบต่อนาที ทำให้สามารถแยกสารของเหลวออกจากของแข็งได้ดีขึ้น

คุณสมบัติของการเตรียมหลอดสำหรับการปั่นแยก

หลอดทดลองที่ใช้สำหรับการปั่นแยกต้องเติมวัสดุทดสอบที่มีมวลเท่ากัน ดังนั้นจึงใช้สเกลที่มีความแม่นยำสูงพิเศษในการวัดที่นี่ เมื่อจำเป็นต้องปรับสมดุลของหลอดจำนวนมากในเครื่องหมุนเหวี่ยง ให้ใช้เทคนิคต่อไปนี้ หลังจากชั่งน้ำหนักภาชนะแก้วสองสามใบและมีมวลเท่ากัน ก็จะเหลือภาชนะหนึ่งไว้เป็นมาตรฐาน หลอดต่อมาจะถูกปรับให้สมดุลกับตัวอย่างนี้ก่อนที่จะใส่เข้าไปในอุปกรณ์ เทคนิคนี้ช่วยเร่งการทำงานได้อย่างมากเมื่อจำเป็นต้องเตรียมหลอดทั้งชุดสำหรับการปั่นแยก

เป็นที่น่าสังเกตว่าไม่เคยใส่สารทดสอบมากเกินไปในหลอดทดลอง บรรจุภาชนะแก้วโดยมีระยะห่างจากขอบอย่างน้อย 10 มม. มิฉะนั้นสารจะไหลออกจากหลอดทดลองภายใต้อิทธิพลของแรงเหวี่ยง

เครื่องหมุนเหวี่ยงซุปเปอร์

หากต้องการแยกส่วนประกอบของสารแขวนลอยที่บางมาก การใช้เครื่องหมุนเหวี่ยงแบบธรรมดาหรือแบบธรรมดานั้นไม่เพียงพอ ในกรณีนี้ จำเป็นต้องมีผลกระทบที่น่าประทับใจมากขึ้นต่อสารจากแรงเหวี่ยง เมื่อนำกระบวนการดังกล่าวไปใช้จะใช้เครื่องหมุนเหวี่ยงยิ่งยวด

อุปกรณ์ของแผนที่นำเสนอมีการติดตั้งดรัมตาบอดในรูปแบบของท่อเส้นผ่านศูนย์กลางเล็ก - ไม่เกิน 240 มม. ความยาวของดรัมนั้นเกินหน้าตัดของมันอย่างมากซึ่งทำให้สามารถเพิ่มจำนวนรอบการหมุนได้อย่างมากและสร้างแรงเหวี่ยงที่ทรงพลัง

ในเครื่องหมุนเหวี่ยงซุปเปอร์ สารที่กำลังทดสอบจะเข้าสู่ถังซัก เคลื่อนที่ผ่านท่อ และชนกับตัวสะท้อนแสงแบบพิเศษ ซึ่งจะเหวี่ยงวัสดุไปบนผนังของอุปกรณ์ นอกจากนี้ยังมีห้องที่ออกแบบมาเพื่อแยกของเหลวเบาและหนักออกจากกัน

ข้อดีของซุปเปอร์เซนติฟิวจ์ ได้แก่:

ความรัดกุมแน่นอน;
ความเข้มข้นสูงสุดของการแยกสาร
ขนาดกะทัดรัด
ความสามารถในการแยกสารในระดับโมเลกุล

ในที่สุด

ดังนั้นเราจึงพบว่าการหมุนเหวี่ยงคืออะไร ปัจจุบัน วิธีการนี้สามารถนำไปใช้ได้เมื่อจำเป็นต้องแยกตะกอนออกจากสารละลาย ทำให้ของเหลวบริสุทธิ์ และแยกส่วนประกอบของสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพและสารเคมี Ultracentrifuges ใช้ในการแยกสารในระดับโมเลกุล วิธีการหมุนเหวี่ยงถูกนำมาใช้อย่างแข็งขันในอุตสาหกรรมเคมี น้ำมัน นิวเคลียร์ อาหาร และในทางการแพทย์

วิธีการแช่แข็งชิป

ความเป็นไปได้ใหม่โดยพื้นฐานสำหรับกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนได้เปิดขึ้นเมื่อไม่นานมานี้ หลังจากการพัฒนาวิธี "freezing-cleavage" เมื่อใช้วิธีการนี้ จะมีการตรวจสอบรายละเอียดที่ดีที่สุดของโครงสร้างเซลล์ และได้ภาพสามมิติจากกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน

ในระหว่างการแช่แข็งตามปกติ ผลึกน้ำแข็งจะก่อตัวในเซลล์ ซึ่งทำให้โครงสร้างของพวกมันบิดเบี้ยวอย่างเห็นได้ชัด เพื่อหลีกเลี่ยงปัญหานี้ เซลล์จะถูกแช่แข็งอย่างรวดเร็วที่อุณหภูมิไนโตรเจนเหลว (-196C) ด้วยการแช่แข็งทันที ผลึกน้ำแข็งจะไม่มีเวลาก่อตัว และเซลล์จะไม่เกิดการเสียรูป

บล็อกที่แช่แข็งจะถูกแยกออกด้วยใบมีด (จึงเป็นที่มาของวิธีการ) จากนั้น โดยปกติจะอยู่ในห้องสุญญากาศ น้ำแข็งส่วนเกินจะถูกกำจัดออกโดยการระเหิด การดำเนินการนี้เรียกว่าการแกะสลัก หลังจากการแกะสลัก ความโล่งใจในระนาบความแตกแยกจะชัดเจนยิ่งขึ้น ตัวอย่างที่ได้จะถูกแรเงา นั่นคือชั้นบาง ๆ ของโลหะหนักถูกพ่นลงบนพื้นผิวของตัวอย่าง อย่างไรก็ตาม เคล็ดลับก็คือ การสะสมจะเกิดขึ้นที่มุมกับพื้นผิวของตัวอย่าง นี่เป็นจุดที่สำคัญมาก เอฟเฟ็กต์เงาจะปรากฏขึ้นและภาพมีลักษณะเป็นสามมิติ

ในกล้องจุลทรรศน์แบบส่องผ่าน ลำแสงอิเล็กตรอนสามารถทะลุผ่านส่วนที่บางมากเท่านั้น ตัวอย่างที่แรเงามีความหนาตามปกติมากเกินไป ดังนั้นอินทรียวัตถุที่อยู่ใต้ชั้นโลหะจึงต้องถูกละลาย ผลลัพธ์ที่ได้คือแบบจำลองโลหะบางๆ (หรือรอยพิมพ์) ของพื้นผิวตัวอย่าง แบบจำลองถูกใช้ในกล้องจุลทรรศน์แบบส่องผ่าน

ตัวอย่างเช่น วิธีการนี้ให้โอกาสพิเศษในการสังเกตโครงสร้างภายในของเยื่อหุ้มเซลล์

การหมุนเหวี่ยงแบบดิฟเฟอเรนเชียล

นอกจากการใช้กล้องจุลทรรศน์แล้ว วิธีหลักอีกวิธีหนึ่งที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในการศึกษาเซลล์คือการปั่นแยกหรือการแยกส่วน

หลักการของวิธีการนี้คือในระหว่างการปั่นแยกแรงเหวี่ยงจะเกิดขึ้นภายใต้อิทธิพลที่อนุภาคแขวนลอยจะตกลงไปที่ด้านล่างของหลอดหมุนเหวี่ยง

ด้วยการเปิดตัวเครื่องหมุนเหวี่ยงแบบอุลตร้าเซนตริฟิวจ์ในช่วงต้นทศวรรษ 1940 การแยกส่วนประกอบของเซลล์จึงเป็นไปได้

ก่อนที่จะนำเซลล์ไปปั่นแยกเซลล์จะต้องถูกทำลาย - ต้องทำลายกรอบแข็งของเยื่อหุ้มเซลล์ ในการทำเช่นนี้มีการใช้วิธีการต่างๆ: การสั่นสะเทือนแบบอัลตราโซนิกการกดผ่านรูเล็ก ๆ หรือการบดเนื้อเยื่อพืชที่พบบ่อยที่สุดด้วยสากในครกพอร์ซเลน ด้วยการใช้วิธีการทำลายอย่างระมัดระวัง ออร์แกเนลล์บางชนิดสามารถรักษาสภาพเดิมได้

ในระหว่างการปั่นเหวี่ยงด้วยความเร็วสูง ส่วนประกอบของเซลล์ขนาดใหญ่ (เช่น นิวเคลียส) จะเกาะตัว (ตะกอน) อย่างรวดเร็วด้วยความเร็วที่ค่อนข้างต่ำ และก่อตัวเป็นตะกอนที่ด้านล่างของหลอดเหวี่ยง ในอัตราที่สูงกว่า ส่วนประกอบที่มีขนาดเล็ก เช่น คลอโรพลาสต์และไมโตคอนเดรียจะตกตะกอน

นั่นคือในระหว่างการปั่นแยกส่วนประกอบของเซลล์จะแบ่งออกเป็นเศษส่วน: ใหญ่และเล็กซึ่งเป็นสาเหตุที่ชื่อที่สองของวิธีการ? การแยกส่วน ยิ่งไปกว่านั้น ยิ่งความเร็วและระยะเวลาในการปั่นแยกสูงเท่าไร เศษส่วนที่ได้ก็จะยิ่งละเอียดมากขึ้นเท่านั้น

อัตราการตกตะกอน (การทับถม) ของส่วนประกอบแสดงโดยใช้สัมประสิทธิ์การตกตะกอน ซึ่งแสดงด้วย S

ขั้นตอนของการปั่นแยกที่แตกต่างกัน: ความเร็วต่ำ (นิวเคลียส, โครงร่างโครงกระดูก), ความเร็วปานกลาง (คลอโรพลาสต์), ความเร็วสูง (ไมโตคอนเดรีย, เหง้า, ไมโครบอดี), ความเร็วสูงมาก (ไรโบโซม)

สารสกัดเซลล์แบบแยกส่วนหรือที่เรียกว่าระบบไร้เซลล์ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในการศึกษากระบวนการภายในเซลล์ การทำงานกับสารสกัดไร้เซลล์เท่านั้นจึงจะสามารถสร้างกลไกระดับโมเลกุลโดยละเอียดของกระบวนการทางชีววิทยาได้ ดังนั้นการใช้วิธีการเฉพาะนี้จึงประสบความสำเร็จอย่างมีชัยในการศึกษาการสังเคราะห์โปรตีน

โดยทั่วไปแล้วเศษส่วนบริสุทธิ์ของโครงสร้างภายในเซลล์สามารถถูกวิเคราะห์ประเภทใดก็ได้

วิธีการเพาะเลี้ยงเซลล์

เซลล์สัตว์ที่ถูกแยกออกมาในการเพาะเลี้ยง (นั่นคือ วางบนอาหารเลี้ยงเชื้อ) จะตายหลังจากการแบ่งตัวจำนวนหนึ่ง ดังนั้นจึงถือเป็นวัตถุที่ยากและไม่สะดวกในการเพาะปลูก อีกอย่างคือเซลล์พืชซึ่งสามารถแบ่งได้ไม่จำกัดจำนวนครั้ง

วิธีการเพาะเลี้ยงเซลล์เอื้อต่อการศึกษากลไกการแยกเซลล์ในพืช

บนอาหารเลี้ยงเซลล์ เซลล์พืชจะสร้างมวลเซลล์ที่ไม่แตกต่างกันซึ่งเป็นเนื้อเดียวกัน - แคลลัส แคลลัสรักษาด้วยฮอร์โมน ภายใต้อิทธิพลของฮอร์โมน เซลล์แคลลัสสามารถก่อให้เกิดอวัยวะต่างๆ

วิธีการหมุนเหวี่ยงแบบดิฟเฟอเรนเชียล วิธีการหมุนเหวี่ยงแบบดิฟเฟอเรนเชียล
การหมุนเหวี่ยงใช้สำหรับ
การแยกส่วนของเซลล์เช่น การแยกเซลล์
เนื้อหาเป็นเศษส่วนขึ้นอยู่กับเฉพาะ
น้ำหนักของออร์แกเนลล์ต่างๆ และการรวมเซลล์
อันเป็นผลมาจากการปั่นแยกส่วนประกอบต่างๆ
เซลล์ตกตะกอนจากสารละลายตกตะกอน
ตามความหนาแน่นของมัน มีความหนาแน่นมากขึ้น
โครงสร้างชำระในอัตราที่ต่ำกว่า
การหมุนเหวี่ยงและการหมุนเหวี่ยงที่มีความหนาแน่นน้อยกว่า - ที่ระดับสูง
ความเร็ว

1. เรียกว่าวิธีการแยกออร์แกเนลล์ออกจากเซลล์
การแยกส่วน วิธีการนี้ได้ผลมากคือการให้
นักชีวเคมีสามารถแยกออร์แกเนลล์ของเซลล์ต่างๆ ได้
รูปแบบที่ค่อนข้างบริสุทธิ์ นอกจากนี้ยังช่วยให้คุณกำหนดได้
องค์ประกอบทางเคมีของออร์แกเนลล์และเอนไซม์ที่มีและ
จากข้อมูลที่ได้รับ ให้สรุปเกี่ยวกับหน้าที่ของพวกเขา
กรง. โดยในขั้นตอนแรกเซลล์จะถูกทำลายด้วย
ทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในตัวกลางที่เหมาะสมบางชนิดซึ่ง
ทำให้มั่นใจในความปลอดภัยของออร์แกเนลล์และป้องกันการรวมตัวกัน
2. ในขั้นตอนต่อไป เซลล์ที่เป็นเนื้อเดียวกันจะต้องผ่านชุดของ
การปั่นแยกด้วยความเร็วและระยะเวลาในแต่ละครั้ง
เพิ่มขึ้น; กระบวนการนี้เรียกว่าดิฟเฟอเรนเชียล
การหมุนเหวี่ยง ออร์แกเนลล์ของเซลล์ต่างๆ สะสมอยู่ที่ด้านล่าง
หลอดหมุนเหวี่ยงที่ความเร็วการหมุนเหวี่ยงต่างกัน
ซึ่งขึ้นอยู่กับขนาด ความหนาแน่น และรูปร่างของออร์แกเนลล์

ขั้นตอนของการปั่นแยกที่แตกต่างกัน:

3. สามารถเก็บตะกอนที่เกิดขึ้นได้และ
วิจัย. สิ่งเหล่านี้เป็นวิธีที่เร็วที่สุดในการชำระบัญชี
โครงสร้างขนาดใหญ่และหนาแน่น เช่น นิวเคลียส และสำหรับ
การตกตะกอนมีขนาดเล็กลงและมีความหนาแน่นน้อยลง
โครงสร้างต่างๆ เช่น ฟองอากาศ
จำเป็นต้องมีเอนโดพลาสซึมเรติคูลัม
ความเร็วที่สูงขึ้นและนานขึ้น
เวลา. ดังนั้นที่ความเร็วต่ำ
การหมุนเหวี่ยงนิวเคลียสจะตกตะกอนและ
ออร์แกเนลล์ของเซลล์อื่นๆ ยังคงอยู่
สารแขวนลอย

ขั้นตอนของการปั่นแยกที่แตกต่างกัน:

4. เมื่อทำการปั่นแยก ก่อนอื่นและเมื่อใด
ที่ความเร่งเล็กน้อย (1-3 พันกรัม) นิวเคลียสจะจับตัวและ
เซลล์ที่ไม่ถูกทำลายจะอยู่ที่ 15-30,000 กรัม
อนุภาคขนาดใหญ่ มาโครโซม ประกอบด้วย
ไมโตคอนเดรีย, พลาสติดขนาดเล็ก, เพอรอกซิโซม, ไลโซโซม
เป็นต้น ที่ไมโครโซมและชิ้นส่วนจำนวน 50,000 กรัมจะตกลงกัน
ระบบแวคิวโอลาร์ของเซลล์
สามารถตรวจสอบปริมาณน้ำฝนได้โดยใช้
กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนเพื่อตรวจสอบความบริสุทธิ์
เศษส่วนผลลัพธ์ ทุกฝ่ายได้ในระดับหนึ่ง
องศามีการปนเปื้อนกับออร์แกเนลล์อื่น ถ้าใช่
เป็นไปไม่ได้เลยที่จะได้ความสะอาดเพียงพอ
เศษส่วนเหล่านั้นจะถูกนำไปผ่านชีวเคมี
การวิเคราะห์เพื่อกำหนดองค์ประกอบทางเคมีและ
กิจกรรมของเอนไซม์ของออร์แกเนลล์ที่แยกได้

การปั่นแยกด้วยเกรเดียนต์ของความหนาแน่น

ล่าสุดมีการสร้างวิธีการอื่นขึ้นมา
การแยกเซลล์ - การหมุนเหวี่ยง
ในการไล่ระดับความหนาแน่น สิ่งนั้น
การหมุนเหวี่ยงจะดำเนินการในหลอดทดลองใน
ซึ่งก่อนหน้านี้ซ้อนกันเป็นชั้นๆ
สารละลายซูโครสของความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้น
และส่งผลให้มีความหนาแน่นเพิ่มขึ้น ที่
การหมุนเหวี่ยงที่มีอยู่ในโฮโมจีเนท
ออร์แกเนลล์อยู่ในหลอดหมุนเหวี่ยง
ในระดับที่มีการแก้ปัญหาอยู่
ซูโครสที่สอดคล้องกับความหนาแน่น

การบรรยายครั้งที่ 3

จำนวนชั่วโมง: 2

วิธีการศึกษาเซลล์

1. กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง

2. กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน, นข้อดีและข้อเสีย ประเภทของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน

เซลล์มีขนาดเล็กมากและมีโครงสร้างที่ซับซ้อนในเวลาเดียวกัน ดังนั้นเพื่อที่จะศึกษาโครงสร้างและการทำงานของเซลล์ได้สำเร็จจึงจำเป็นต้องรู้และเชี่ยวชาญวิธีการทดลองที่เหมาะสม

ในระยะแรกของการพัฒนาเซลล์วิทยา วิธีเดียวที่จะศึกษาเซลล์ได้คือ กล้องจุลทรรศน์แสง.

กล้องจุลทรรศน์เป็นอุปกรณ์ที่ช่วยให้ได้ภาพขยายของวัตถุขนาดเล็กที่ไม่สามารถมองเห็นได้ด้วยตาเปล่า หน่วยความยาวต่อไปนี้มักใช้ในกล้องจุลทรรศน์:

ไมโครมิเตอร์ (1 µm – 10 -6 ม.)

นาโนเมตร (1 นาโนเมตร – 10 -9 เมตร)

อังสตรอม (1Å – 10 -10 ม.)

มีกล้องจุลทรรศน์แบบแสงและอิเล็กตรอน กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงใช้แสงเพื่อสร้างภาพขยาย ในขณะที่กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนใช้กระแสอิเล็กตรอน คุณภาพของภาพจะขึ้นอยู่กับความละเอียดของกล้องจุลทรรศน์ ความละเอียดคือระยะทางที่เล็กที่สุดที่เลนส์ของกล้องจุลทรรศน์สามารถแยกจุดสองจุดที่มีระยะห่างใกล้เคียงกัน ปณิธานดวงตาของมนุษย์มีขนาดประมาณ 100 ไมครอน ซึ่งหมายความว่าด้วยตาเปล่า ที่ระยะ 25 ซม. ผู้สังเกตการณ์ที่มีการมองเห็นโดยเฉลี่ยสามารถแยกแยะจุดหนึ่งจากอีกจุดหนึ่งได้ หากจุดเหล่านั้นอยู่ห่างจากกันอย่างน้อย 100 ไมโครเมตร หากจุดที่เป็นปัญหาอยู่ห่างกันน้อยกว่า 100 µm ดูเหมือนว่าเป็นจุดที่พร่ามัวจุดหนึ่ง กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงสมัยใหม่ที่ดีที่สุดทำให้สามารถตรวจสอบโครงสร้างที่มีระยะห่างระหว่างองค์ประกอบประมาณ 0.25 ไมครอน กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน - ประมาณ 1.5 A

กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง เป็นชุดวิธีการสังเกตวัตถุจุลภาคโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบต่างๆ วิธีการเหล่านี้ขึ้นอยู่กับประเภทของเลนส์กล้องจุลทรรศน์ อุปกรณ์เสริม ประเภทของวัตถุขนาดเล็ก และวิธีการเตรียมเลนส์สำหรับการสังเกต ตลอดจนลักษณะของการส่องสว่างในระหว่างการสังเกต ความละเอียดของกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงถูกจำกัดด้วยขนาดที่เทียบได้กับความยาวคลื่นของแสง (0.4–0.7 μm สำหรับแสงที่มองเห็นได้) อย่างไรก็ตาม องค์ประกอบหลายอย่างในโครงสร้างเซลล์มีขนาดเล็กกว่ามาก นอกจากนี้ เมื่อใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงแบบธรรมดา โครงสร้างส่วนใหญ่ของเซลล์ที่มีชีวิตจะเป็นเช่นนั้น ว่างเปล่าทางสายตาโครงสร้างที่ว่างเปล่าเชิงการมองเห็นคือโครงสร้างที่โปร่งใสและแทบไม่มีดัชนีการหักเหของแสงแตกต่างจากสภาพแวดล้อมโดยรอบ มีการพัฒนาวิธีการต่าง ๆ เพื่อระบุโครงสร้างดังกล่าว การตรึงและ ระบายสีวัสดุ.

การตรึงคือการรักษาที่จะขัดขวางกระบวนการสำคัญของเซลล์อย่างรวดเร็ว และรักษาโครงสร้างของเซลล์และเนื้อเยื่อให้ไม่เปลี่ยนแปลงเท่าที่จะทำได้ หลังจากการตรึง เซลล์จะซึมผ่านสีย้อมได้ ตำแหน่งได้รับการแก้ไข และโครงสร้างของโมเลกุลขนาดใหญ่จะเสถียร

การระบายสีใช้สำหรับการสร้างความแตกต่างทางแสงของโครงสร้างเซลล์ เช่นเดียวกับในการศึกษาทางไซโตเคมีเพื่อระบุตำแหน่งของสารประกอบทางเคมี ตัวอย่างเช่น สีย้อมพื้นฐาน (ฮีมาทอกซิลิน) มีความสัมพันธ์กับปริมาณนิวเคลียร์ ในขณะที่สีย้อมที่เป็นกรด (อีโอซิน) จะเปื้อนไซโตพลาสซึม ใช้เพื่อศึกษาเซลล์ของสิ่งมีชีวิต สีย้อมสำคัญ (อายุการใช้งาน)- สีย้อมสำคัญจะแทรกซึมเซลล์ที่มีชีวิตได้ค่อนข้างง่ายและทำให้โครงสร้างบางส่วนเปื้อนโดยไม่ทำลายเซลล์เหล่านั้น อย่างไรก็ตาม สีย้อมสำคัญไม่ได้เป็นอันตรายต่อเซลล์โดยสิ้นเชิง และเมื่อสัมผัสเป็นเวลานาน สีก็จะนำไปสู่ความตาย สีย้อมสำคัญได้แก่ สีแดงที่เป็นกลาง(สำหรับการย้อมสีไซโตพลาสซึม) เมทิลีนสีน้ำเงิน(การย้อมสีของ Golgi complex) เป็นต้น การใช้สีย้อมสำคัญทำให้สามารถพิสูจน์การมีอยู่ของออร์แกเนลล์ของเซลล์บางชนิดได้ ซึ่งก่อนหน้านี้เคยเข้าใจผิดว่าเป็นสิ่งประดิษฐ์

สิ่งประดิษฐ์- การเปลี่ยนแปลงที่เกิดขึ้นระหว่างการเตรียมยา

ก่อนการทดสอบ เซลล์หรือชิ้นส่วนของเนื้อเยื่อมักจะถูกเทลงในพาราฟินหลอมเหลวหรือเรซินชนิดพิเศษ ตัวกลางที่ใช้ในการหล่อจะถูกทำให้เย็นลงหรือเกิดปฏิกิริยาโพลีเมอร์ ซึ่งส่งผลให้เกิดบล็อกแข็ง ซึ่งถูกตัดเป็นส่วนที่บางมากโดยใช้ไมโครโตม โดยทั่วไป ความหนาของส่วนต่างๆ สำหรับกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงคือ 1-10 µm ข้อเสียของวิธีนี้คือความเสียหายต่อโครงสร้างเซลล์จำนวนหนึ่ง ดังนั้นจึงใช้วิธีการเตรียมส่วนต่างๆ โดยใช้การแช่แข็งแบบด่วน เนื้อเยื่อแช่แข็งถูกตัดด้วยไมโครโตมพิเศษ (ไครโอโตม) ที่ติดตั้งห้องเย็น (ไครโอสแตท)

นอกเหนือจากกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงแบบธรรมดาแล้ว เซลล์ยังได้รับการศึกษาโดยใช้สนามมืด คอนทราสต์เฟส การเรืองแสง และกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงประเภทอื่นๆ

กล้องจุลทรรศน์สนามมืด กล้องจุลทรรศน์สนามมืดมีคอนเดนเซอร์พิเศษแตกต่างจากกล้องจุลทรรศน์ทั่วไป คอนเดนเซอร์มีไดอะแฟรมสีเข้มซึ่งไม่ส่งแสงไปยังจุดศูนย์กลางการมองเห็น ดังนั้นวัตถุจึงได้รับแสงสว่างจากลำแสงเฉียง ในกรณีนี้ มีเพียงรังสีที่สะท้อนและกระเจิงจากพื้นผิวของวัตถุเท่านั้นที่เข้าสู่เลนส์กล้องจุลทรรศน์ ซึ่งจะเพิ่มคอนทราสต์ของโครงสร้างบางส่วนและทำให้มองเห็นได้ กล้องจุลทรรศน์สนามมืดใช้ในการสังเกตโครงสร้างจำนวนหนึ่งในเซลล์ที่มีชีวิต โดยเฉพาะอย่างยิ่ง กล้องจุลทรรศน์สนามมืดถูกนำมาใช้เพื่อระบุความถี่ของความเสียหายของอะโครโซมในเซลล์อสุจิของสัตว์เลี้ยงในฟาร์ม

กล้องจุลทรรศน์คอนทราสต์เฟส กล้องจุลทรรศน์คอนทราสต์เฟสได้รับการออกแบบโดย Fritz Zernike ในปี 1932 กล้องจุลทรรศน์คอนทราสต์เฟสเป็นวิธีการที่ดีเยี่ยมในการสังเกตเซลล์ในหลอดเลือด ใช้เพื่อศึกษาออร์แกเนลล์และโครโมโซมของเซลล์จำนวนมากในระหว่างการแบ่งตัว คอนเดนเซอร์ของกล้องจุลทรรศน์คอนทราสต์แบบเฟสมีไดอะแฟรมรูปวงแหวนซึ่งแสงส่องผ่านในรูปกรวยกลวง และรังสีที่เหลือจะถูกดูดซับ เลนส์ประกอบด้วยแผ่นเฟสซึ่งเป็นดิสก์โปร่งใสและมีรอยบาก รูปร่างและขนาดของรอยบากตรงกับภาพโดยตรงของไดอะแฟรมรูปวงแหวน เมื่อวางวัตถุระหว่างคอนเดนเซอร์และเลนส์ในระนาบโฟกัสด้านหลังของเลนส์ นอกเหนือจากภาพโดยตรงแล้ว ภาพการเลี้ยวเบนของรูรับแสงที่ทับซ้อนกันหลายภาพจะปรากฏขึ้น รอยบากของแผ่นเฟสได้รับการคำนวณเพื่อให้ลำแสงทั้งสองที่สร้างภาพโดยตรงและการเลี้ยวเบนต่างกันไปตามเส้นทางแสงประมาณหนึ่งในสี่ของความยาวคลื่น ดังนั้นความแตกต่างของเฟสซึ่งก่อนหน้านี้มองไม่เห็นด้วยตาจะถูกแปลงเป็นความแตกต่างของความเข้มและมองเห็นได้

กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง เป็นวิธีที่ดีในการสังเกตเซลล์ภายในร่างกาย กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ช่วยให้คุณสังเกตการเรืองแสง (การเรืองแสง) ของสารและโครงสร้างเซลล์จำนวนหนึ่ง การเรืองแสงของวัตถุถูกกระตุ้นด้วยรังสีอัลตราไวโอเลตหรือรังสีสีน้ำเงินม่วงจากแหล่งกำเนิดแสงพิเศษ การแผ่รังสีจากวัตถุจะมีความยาวคลื่นมากกว่าแสงที่น่าตื่นเต้นเสมอ วัตถุนี้มองเห็นได้ในรังสีเรืองแสง ซึ่งแยกออกจากรังสีของแสงที่น่าตื่นเต้นโดยใช้ฟิลเตอร์แสง สารจำนวนหนึ่ง (วิตามิน เม็ดสี ไขมันบางชนิด) มีการเรืองแสง (หลัก) ของตัวเอง สารเซลล์ที่ไม่มีคุณสมบัตินี้จะถูกย้อมด้วยสีย้อมพิเศษล่วงหน้า - ฟลูออโรโครมจากนั้นจึงสังเกตการเรืองแสงทุติยภูมิ

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนใช้กระแสอิเล็กตรอนในสุญญากาศแทนแสงเพื่อสร้างภาพ ลำอิเล็กตรอนไม่ได้ถูกโฟกัสโดยเลนส์ เหมือนในกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง แต่ถูกโฟกัสโดยสนามแม่เหล็กไฟฟ้า ภาพจะถูกสังเกตบนหน้าจอฟลูออเรสเซนต์และถ่ายภาพ วัตถุระหว่างกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนจะอยู่ในสุญญากาศลึก ดังนั้นพวกมันจึงถูกตรึงและดูแลเป็นพิเศษก่อน ด้วยเหตุนี้จึงสามารถศึกษาได้เฉพาะเซลล์ที่ถูกฆ่าโดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน นอกจากนี้พวกมันจะต้องบางมากเนื่องจากการไหลของอิเล็กตรอนถูกวัตถุดูดซับอย่างแรง ในเรื่องนี้จะใช้ส่วนที่บางเฉียบที่มีความหนา 20-50 นาโนเมตรบนฟิล์มที่บางที่สุดเป็นวัตถุ ใน กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (ส่ง)อิเล็กตรอนผ่านวัตถุในลักษณะเดียวกับที่แสงส่องผ่านวัตถุนั้นด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านใช้เพื่อศึกษาส่วนที่บางเฉียบของจุลินทรีย์ เนื้อเยื่อ รวมถึงโครงสร้างของวัตถุขนาดเล็ก (ไวรัส แฟลเจลลา ฯลฯ) ใน กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราดลำแสงอิเล็กตรอนที่โฟกัสอย่างแม่นยำจะเคลื่อนที่ไปมาบนพื้นผิวของตัวอย่าง ในกรณีนี้ อิเลคตรอนที่สะท้อนจากพื้นผิวจะถูกรวบรวมและสร้างเป็นภาพ ข้อดีของการใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนชนิดนี้คือสร้างภาพสามมิติได้ ดังนั้นจึงใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราดเพื่อศึกษาพื้นผิวของวัตถุ กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนมีความละเอียดประมาณ 1–2 นาโนเมตร เพียงพอที่จะศึกษาโมเลกุลขนาดใหญ่

การถ่ายภาพอัตโนมัติ วิธีการนี้ขึ้นอยู่กับการใช้สารที่มีฉลากไอโซโทปกัมมันตภาพรังสี หากมีการเติมไอโซโทปกัมมันตภาพรังสีลงในตัวกลางและเซลล์ดูดซับในระหว่างการเผาผลาญ ต่อมาสามารถตรวจพบตำแหน่งภายในเซลล์ได้โดยใช้การถ่ายภาพด้วยรังสีอัตโนมัติ ด้วยวิธีนี้ เซลล์บางส่วนจะถูกวางลงบนแผ่นฟิล์ม ฟิล์มจะมืดลงใต้บริเวณที่มีไอโซโทปกัมมันตภาพรังสีอยู่ ฟอสฟอรัสใช้เป็นไอโซโทป ( P 32), เหล็ก (Fe 59), ซัลเฟอร์ (S 35 ), คาร์บอน (C 14), ไอโซโทป (ฮ 3 ) ฯลฯ

การหมุนเหวี่ยง วิธีการนี้เริ่มต้นขึ้นในปี 1926 เมื่อ Svedberg คิดค้นเครื่องหมุนเหวี่ยงเชิงวิเคราะห์ และใช้มันเพื่อกำหนดน้ำหนักโมเลกุลของฮีโมโกลบิน ก่อนการปั่นแยกจำเป็นต้องทำลายเยื่อหุ้มเซลล์ การทำลายล้างทำได้โดยใช้การสั่นสะเทือนแบบอัลตราโซนิก การกระแทกแบบออสโมติก การเจียร และการกดผ่านรูเล็กๆ เมื่อทำลายอย่างระมัดระวัง ออร์แกเนลล์ของเซลล์บางส่วนยังคงไม่บุบสลาย เนื้อเยื่อที่ถูกสับและเยื่อหุ้มเซลล์ที่ถูกทำลายจะถูกนำไปใส่ในหลอดทดลองและหมุนด้วยเครื่องหมุนเหวี่ยงด้วยความเร็วสูง วิธีการนี้ขึ้นอยู่กับความจริงที่ว่าออร์แกเนลล์ของเซลล์ต่างกันมีมวลและความหนาแน่นต่างกัน ออร์แกเนลล์ที่มีความหนาแน่นมากขึ้นจะถูกสะสมอยู่ในหลอดทดลองที่ความเร็วการหมุนเหวี่ยงต่ำ และมีออร์แกเนลล์ที่มีความหนาแน่นน้อยกว่าที่ความเร็วสูง เลเยอร์เหล่านี้ได้รับการศึกษาแยกกัน ดังนั้นนิวเคลียสและเซลล์ที่ยังไม่ถูกทำลายจะตกลงอย่างรวดเร็วด้วยความเร็วที่ค่อนข้างต่ำ และก่อตัวเป็นตะกอนที่ด้านล่างของหลอดหมุนเหวี่ยง ที่ความเร็วที่สูงขึ้น ไมโตคอนเดรียจะตกตะกอน และที่ความเร็วที่สูงขึ้นและระยะเวลาการปั่นแยกที่นานขึ้น ไรโบโซมก็จะตกตะกอน โดยทั่วไปแล้ว ส่วนประกอบที่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์ดังกล่าวจะยังคงมีฤทธิ์ทางชีวเคมีสูง

วิธีการเพาะเลี้ยงเซลล์และเนื้อเยื่อ ประกอบด้วยความจริงที่ว่าจากหนึ่งหรือหลายเซลล์บนสารอาหารพิเศษสามารถรับกลุ่มของเซลล์ประเภทเดียวกันได้ วิธีการนี้มีโอกาสมหาศาลไม่เพียงแต่สำหรับเซลล์วิทยาเท่านั้น แต่ยังรวมถึงการแพทย์และการเกษตรด้วย ดังนั้น การเพาะเลี้ยงเซลล์จึงถูกนำมาใช้เพื่อชี้แจงรูปแบบของความแตกต่าง ปฏิสัมพันธ์ของเซลล์กับสิ่งแวดล้อม การปรับตัว การแก่ชรา การเปลี่ยนแปลง ฯลฯ ในเทคโนโลยีชีวภาพ การเพาะเลี้ยงเซลล์ถูกนำมาใช้ในการผลิตวัคซีนและสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพ ในทางเภสัชวิทยา พวกมันถูกใช้เป็นวัตถุทดสอบเมื่อทำการทดสอบยาใหม่ ผู้ก่อตั้งวิธีนี้คือนักสัตววิทยาและนักเพาะพันธุ์ตัวอ่อนชาวอเมริกัน R. Garrison (พ.ศ. 2422-2502) ซึ่งในปี พ.ศ. 2450 สามารถปลูกฝังเซลล์ซาลาแมนเดอร์ในสภาพแวดล้อมเทียมภายนอกร่างกายได้ ต่อมาได้มีการปลูกเซลล์พืชและเซลล์สัตว์หลายชนิดในหลอดทดลอง และวิธีนี้ช่วยให้เราสามารถค้นพบที่สำคัญหลายประการในสาขาสรีรวิทยาของเซลล์ การแสดงออกในหลอดทดลอง (ภาษาละตินแปลว่า "ในแก้ว") หมายความว่าการวิจัยไม่ได้ดำเนินการกับสิ่งมีชีวิต แต่ดำเนินการในภาชนะแก้วชนิดใดชนิดหนึ่ง ตรงกันข้ามกับสำนวนแรกในร่างกาย หมายถึงการทดลองกับสิ่งมีชีวิตทั้งตัว เรียกว่าการเพาะเลี้ยงที่เตรียมจากเนื้อเยื่อของร่างกายโดยตรง พืชผลหลักในกรณีส่วนใหญ่ เซลล์เพาะเลี้ยงปฐมภูมิสามารถถ่ายโอนจากจานเพาะเลี้ยงและนำไปใช้ในการผลิตปริมาณมากได้ พืชผลรองเส้นเซลล์สามารถใช้เพื่อสร้างโคลนที่ได้มาจากเซลล์ต้นกำเนิดเซลล์เดียว สามารถทำได้ ฟิวชั่นของเซลล์หนึ่งหรือประเภทที่แตกต่างกัน เพื่อให้เกิดการหลอมรวม เซลล์จะต้องสัมผัสกับเอนไซม์ของไวรัสหรือโพลีเอทิลีนไกลคอล สารเหล่านี้ทำลายพลาสมาเมมเบรนของเซลล์ ส่งผลให้เซลล์มีนิวเคลียสสองอันแยกจากกัน หลังจากช่วงระยะเวลาหนึ่ง เซลล์ดังกล่าวจะแบ่งตัวตามไมโทซีส กลายเป็นเซลล์ลูกผสม ในเซลล์ลูกผสม โครโมโซมทั้งหมดจะรวมกันเป็นนิวเคลียสขนาดใหญ่อันเดียว เซลล์ลูกผสมดังกล่าวสามารถถูกโคลนเพื่อสร้างเซลล์ลูกผสมได้ เมื่อใช้วิธีการนี้ เป็นไปได้ที่จะได้รับเซลล์ลูกผสมระหว่างมนุษย์กับหนู มนุษย์และคางคก เซลล์ลูกผสมที่เกิดขึ้นนั้นไม่เสถียร และหลังจากการแบ่งเซลล์หลายครั้ง โครโมโซมส่วนใหญ่จะสูญเสียไปประเภทใดประเภทหนึ่ง ตัวอย่างเช่น ผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้ายจะกลายเป็นเซลล์ของเมาส์โดยไม่มียีนของมนุษย์หรือมีเพียงร่องรอยเล็กน้อย ดังนั้นเทคนิคนี้จึงสามารถนำไปใช้ในการจับคู่ยีนในโครโมโซมของมนุษย์ได้สำเร็จ

การผ่าตัดด้วยไมโครวิธีการนี้ขึ้นอยู่กับการใช้ไมโครมานิปูเลเตอร์ เป็นอุปกรณ์ที่ให้การเคลื่อนไหวที่แม่นยำของเครื่องมือขนาดเล็กในกรง เครื่องมือไมโครมักทำจากแก้ว แบบฟอร์มของพวกเขาถูกกำหนดโดยงานของการผ่าตัดทางจุลศัลยกรรม พวกเขาสามารถอยู่ในรูปแบบของเข็ม, กระบอกฉีดยา, ปิเปต, ไม้พาย, มีดผ่าตัด ฯลฯ การใช้ไมโครมานิปูเลเตอร์สามารถดำเนินการต่าง ๆ บนเซลล์ได้ (การฉีดสารเข้าไปในเซลล์, การสกัดและการปลูกถ่ายนิวเคลียส, ความเสียหายเฉพาะที่ต่อโครงสร้างเซลล์ ฯลฯ ) การผ่าตัดด้วยจุลศัลยกรรมทำงานได้ดีโดยเฉพาะกับเซลล์ขนาดใหญ่ (เซลล์เดียว ไข่สัตว์ครึ่งบกครึ่งน้ำ เซลล์ตัวอ่อนของสัตว์บางชนิด) ดังนั้นเซลล์อะมีบาจึงสามารถแบ่งออกเป็นองค์ประกอบหลักได้สามส่วน ได้แก่ เมมเบรน ไซโตพลาสซึม และนิวเคลียส ส่วนประกอบเหล่านี้สามารถประกอบกลับเป็นเซลล์ที่มีชีวิตได้ ด้วยวิธีนี้สามารถรับเซลล์เทียมที่ประกอบด้วยส่วนประกอบของอะมีบาประเภทต่างๆ การผ่าตัดด้วยจุลศัลยกรรมนั้นไม่เพียงดำเนินการด้วยเครื่องมือขนาดเล็กเท่านั้น แต่ยังมีลำแสงอัลตราไวโอเลตที่โฟกัส (การฉีดไมโครบีม)

นอกเหนือจากวิธีการข้างต้นแล้ว ยังใช้โครมาโตกราฟี อิเล็กโตรโฟเรซิส และอื่นๆ ในการศึกษาเซลล์อีกด้วย วิธีการใหม่ทำให้เกิดความก้าวหน้าอย่างมากในการศึกษาเซลล์ อย่างไรก็ตาม ควรจำไว้ว่าวิธีการทางเซลล์วิทยาแบบคลาสสิกซึ่งมีพื้นฐานจากการตรึง การย้อมสี และการศึกษาเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง ยังคงมีความสำคัญในทางปฏิบัติ

การบรรยายครั้งที่ 1

โครงสร้างเซลล์พืช

กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน

การหมุนเหวี่ยงแบบดิฟเฟอเรนเชียล

วิธีการเพาะเลี้ยงเซลล์

เซลล์เป็นหน่วยโครงสร้างพื้นฐานและหน้าที่ของสิ่งมีชีวิต

เซลล์ ตัวอ่อน(ไม่เฉพาะเจาะจง) เนื้อเยื่อของสัตว์และพืชในแง่โครงสร้างโดยทั่วไปมีความคล้ายคลึงกันมาก นี่เป็นเหตุการณ์ที่ครั้งหนึ่งเป็นสาเหตุของการเกิดขึ้นและการพัฒนาของทฤษฎีเซลล์ ความแตกต่างทางสัณฐานวิทยาปรากฏในเซลล์ที่แตกต่างกันของเนื้อเยื่อเฉพาะของพืชและสัตว์ ลักษณะทางโครงสร้างของเซลล์พืช เช่นเดียวกับพืชโดยรวม มีความเกี่ยวข้องกับวิถีชีวิตและโภชนาการ พืชส่วนใหญ่มีวิถีชีวิตที่ค่อนข้างไม่เคลื่อนไหว (ยึดติด) ความจำเพาะของธาตุอาหารพืชคือน้ำและสารอาหาร: อินทรีย์และอนินทรีย์ กระจัดกระจายไปทั่ว และพืชจะต้องดูดซับพวกมันโดยการแพร่กระจาย นอกจากนี้พืชสีเขียวภายใต้แสงยังมีวิธีการให้อาหารแบบออโตโทรฟิค ด้วยเหตุนี้คุณสมบัติเฉพาะบางประการของโครงสร้างและการเติบโตของเซลล์พืชจึงได้รับการพัฒนา ซึ่งรวมถึง:

	ทนทาน ผนังเซลล์โพลีแซ็กคาไรด์ล้อมรอบเซลล์และสร้างกรอบแข็ง
	ระบบพลาสติด ซึ่งเกิดขึ้นจากโภชนาการประเภทออโตโทรฟิก
	ระบบแวคิวโอลาร์ ซึ่งในเซลล์ที่เจริญเต็มที่มักจะแสดงด้วยแวคิวโอลส่วนกลางขนาดใหญ่ ซึ่งครอบครองถึง 95% ของปริมาตรเซลล์และมีบทบาทสำคัญในการรักษา แรงกดดันจากเทอร์กอร์;
	การเจริญเติบโตของเซลล์ชนิดพิเศษโดย เคล็ดขัดยอก(เนื่องจากปริมาตรของแวคิวโอลเพิ่มขึ้น)
	อำนาจเต็ม นั่นคือความเป็นไปได้ในการสร้างพืชที่สมบูรณ์จากเซลล์พืชที่แตกต่าง
	มีรายละเอียดอีกอย่างหนึ่งที่ทำให้เซลล์พืชแตกต่างจากเซลล์สัตว์: ในพืชจะไม่แสดงออกมาระหว่างการแบ่งเซลล์ เซนทริโอล.

คุณรู้จักโครงสร้างของเซลล์ในรูปแบบทั่วไปที่สุดจากหลักสูตรชีววิทยาทั่วไป และในการเตรียมตัวสอบเข้า คุณได้ศึกษาหัวข้อนี้ค่อนข้างดี หัวข้อนี้ยังถูกกล่าวถึงในแง่มุมต่างๆ ในหลักสูตรของมหาวิทยาลัยที่เกี่ยวข้อง (เช่น สัตววิทยาที่ไม่มีกระดูกสันหลัง พืชชั้นล่าง) นอกจากนี้รายละเอียดเพิ่มเติมเกี่ยวกับเซลล์ในระดับสูงจะอยู่ในหลักสูตร "เซลล์วิทยา" เป็นสิ่งสำคัญสำหรับเราที่จะมุ่งเน้นไปที่ลักษณะโครงสร้างเฉพาะของเซลล์พืช ซึ่งส่วนใหญ่เป็นเซลล์ของพืชชั้นสูง

การตรวจสอบโครงสร้างของเซลล์พืชแบบผิวเผินอย่างผิวเผินเผยให้เห็นองค์ประกอบหลักสามประการ: (1) ผนังเซลล์, (2) แวคิวโอลซึ่งครองตำแหน่งศูนย์กลางในเซลล์ที่โตเต็มที่และเติมเต็มปริมาตรเกือบทั้งหมด และ (3) โปรโตพลาสต์ถูกผลักโดยแวคิวโอลไปที่ขอบในรูปแบบของชั้นผนัง เป็นส่วนประกอบเหล่านี้ที่ตรวจพบที่กำลังขยายต่ำของกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง นอกจากนี้เยื่อหุ้มเซลล์และแวคิวโอลยังเป็นผลิตภัณฑ์จากกิจกรรมสำคัญของโปรโตพลาสต์

เซลล์ที่มีชีวิต? โปรโตพลาสต์ประกอบด้วยออร์แกเนลล์ที่แช่อยู่ในนั้น ไฮยาพลาสซึม- สิ่งมีชีวิตของเซลล์ ได้แก่ นิวเคลียส พลาสติด ไมโตคอนเดรีย ไดกโยโซม เอนโดพลาสมิกเรติคูลัม ไมโครบอดี ฯลฯ ไฮยาโลพลาสซึมที่มีออร์แกเนลล์ลบนิวเคลียสคือ ไซโตพลาสซึมเซลล์.

ในการแสดงขนาดของโครงสร้างเซลล์ย่อย จะใช้การวัดความยาวบางอย่าง: ไมโครมิเตอร์และ นาโนเมตร.

ไมโครมิเตอร์ในระบบ SI ของหน่วยวัดมีค่าเท่ากับ 10 -6 เมตร - กล่าวอีกนัยหนึ่ง ไมโครมิเตอร์ (ตัวย่อ µm) คือ 1/1000000 ของเมตร และ 1/1000 ของมิลลิเมตร 1 ไมโครเมตร = 10-6 ม - ชื่อเก่าของวัดนี้ ไมครอน.

นาโนเมตรในระบบเดียวกันแทนหนึ่งในล้านของมิลลิเมตร 1 นาโนเมตร = 10 -9 เมตร และหนึ่งในพันของไมโครเมตร

ขนาดและรูปร่างของเซลล์พืชมีความแตกต่างกันอย่างมาก โดยทั่วไปขนาดเซลล์ของพืชที่สูงขึ้นจะอยู่ระหว่าง 10 ถึง 300 ไมครอน จริงอยู่มีเซลล์ขนาดยักษ์เช่นเซลล์ของเนื้อผลไม้รสเปรี้ยวที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางหลายมิลลิเมตรหรือเส้นใยตำแยที่ยาวมากมีความยาวถึง 80 มม. โดยมีความหนาระดับจุลภาค

โดดเด่นด้วยรูปร่าง มีมิติเท่ากันเซลล์ที่มีขนาดเชิงเส้นในทุกทิศทางเท่ากันหรือแตกต่างกันเล็กน้อย (นั่นคือ ความยาว ความกว้าง และความสูงของเซลล์เหล่านี้เทียบเคียงได้) เซลล์ดังกล่าวเรียกว่าเนื้อเยื่อ (เนื้อเยื่อ).

เซลล์ที่มีความยาวมากซึ่งมีความยาวมากกว่าความสูงและความกว้างหลายเท่า (บางครั้งอาจเป็นหลายร้อยหลายพัน) เรียกว่า prosenchymal (โปรเซนไคมา).

วิธีการศึกษาเซลล์พืช

มีการพัฒนาและใช้วิธีการหลายวิธีในการศึกษาเซลล์ ซึ่งความสามารถในการกำหนดระดับความรู้ของเราในด้านนี้ ความก้าวหน้าในการศึกษาชีววิทยาของเซลล์ รวมถึงความสำเร็จที่โดดเด่นที่สุดในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา มักจะเกี่ยวข้องกับการใช้วิธีการใหม่ ดังนั้นเพื่อความเข้าใจชีววิทยาของเซลล์ให้สมบูรณ์ยิ่งขึ้น อย่างน้อยก็จำเป็นต้องมีความเข้าใจเกี่ยวกับวิธีการศึกษาเซลล์ที่เหมาะสมบ้าง

กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง

วิธีที่เก่าแก่ที่สุดและในเวลาเดียวกันในการศึกษาเซลล์คือการใช้กล้องจุลทรรศน์ เราสามารถพูดได้ว่าจุดเริ่มต้นของการศึกษาเซลล์นั้นเกิดจากการประดิษฐ์กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง

ตาเปล่าของมนุษย์มีความละเอียดประมาณ 1/10 มม. ซึ่งหมายความว่าหากคุณดูเส้นสองเส้นที่ห่างกันน้อยกว่า 0.1 มม. เส้นทั้งสองจะรวมกันเป็นเส้นเดียว เพื่อแยกแยะโครงสร้างที่อยู่ใกล้กันมากขึ้น จึงใช้เครื่องมือทางแสง เช่น กล้องจุลทรรศน์

แต่ความเป็นไปได้ของกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงนั้นมีไม่จำกัด ขีดจำกัดความละเอียดของกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงถูกกำหนดโดยความยาวคลื่นของแสง กล่าวคือ กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงสามารถใช้เพื่อศึกษาโครงสร้างที่มีขนาดต่ำสุดเทียบได้กับความยาวคลื่นของการแผ่รังสีแสงเท่านั้น กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงที่ดีที่สุดมีกำลังการแยกภาพประมาณ 0.2 ไมครอน (หรือ 200 นาโนเมตร) ซึ่งดีกว่าตามนุษย์ประมาณ 500 เท่า ตามทฤษฎีแล้ว เป็นไปไม่ได้ที่จะสร้างกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงที่มีความละเอียดสูง

ส่วนประกอบหลายอย่างของเซลล์มีความหนาแน่นของแสงใกล้เคียงกัน และหากไม่ได้รับการดูแลเป็นพิเศษ แทบจะมองไม่เห็นด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงทั่วไป เพื่อให้มองเห็นได้หลากหลาย สีย้อมด้วยการเลือกสรรบางอย่าง

ในตอนต้นของศตวรรษที่ 19 จำเป็นต้องมีสีย้อมสำหรับการย้อมผ้าสิ่งทอ ซึ่งทำให้เคมีอินทรีย์มีการพัฒนาอย่างรวดเร็ว ปรากฎว่าสีย้อมเหล่านี้บางส่วนยังเปื้อนเนื้อเยื่อชีวภาพ และมักจะจับกับส่วนประกอบบางอย่างของเซลล์ ซึ่งค่อนข้างคาดไม่ถึง การใช้สีย้อมแบบเลือกสรรดังกล่าวทำให้สามารถศึกษาโครงสร้างภายในของเซลล์ได้แม่นยำยิ่งขึ้น นี่เป็นเพียงตัวอย่างบางส่วน:

	ย้อม เฮมาทอกซิลินระบายสีองค์ประกอบบางส่วนของนิวเคลียสเป็นสีน้ำเงินหรือสีม่วง
	หลังจากประมวลผลตามลำดับ โฟลโรกลูซิโนลจากนั้นด้วยกรดไฮโดรคลอริก เยื่อหุ้มเซลล์ที่ถูกทำให้แข็งตัวจะกลายเป็นสีแดงเชอร์รี่
	ย้อม ซูดานที่ 3คราบเยื่อหุ้มเซลล์ suberized สีชมพู;
	สารละลายไอโอดีนที่อ่อนแอในโพแทสเซียมไอโอไดด์จะเปลี่ยนเมล็ดแป้งเป็นสีน้ำเงิน

สำหรับการตรวจเนื้อเยื่อส่วนใหญ่ด้วยกล้องจุลทรรศน์ก่อนการย้อมสี แก้ไข- เมื่อแก้ไขแล้ว เซลล์จะซึมผ่านสีย้อมได้และโครงสร้างเซลล์จะคงตัว สารยึดเกาะที่พบบ่อยที่สุดในพฤกษศาสตร์คือเอทิลแอลกอฮอล์

การตรึงและการย้อมสีไม่ใช่ขั้นตอนเดียวที่ใช้ในการเตรียมการ เนื้อเยื่อส่วนใหญ่หนาเกินกว่าจะสังเกตได้ทันทีที่ความละเอียดสูง ดังนั้นจึงดำเนินการส่วนที่บาง ไมโครโตม- อุปกรณ์นี้ใช้หลักการของเครื่องตัดขนมปัง เนื้อเยื่อพืชต้องการส่วนที่หนากว่าเนื้อเยื่อของสัตว์เล็กน้อย เนื่องจากเซลล์พืชมักจะมีขนาดใหญ่กว่า ความหนาของส่วนเนื้อเยื่อพืชสำหรับกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงอยู่ที่ประมาณ 10 ไมครอน - 20 ไมครอน ทิชชู่บางชนิดอ่อนเกินกว่าจะตัดออกทันที ดังนั้นหลังจากการตรึงแล้วจึงเทลงในพาราฟินหลอมเหลวหรือเรซินพิเศษซึ่งจะทำให้เนื้อผ้าเปียกโชก หลังจากเย็นตัวลง จะเกิดบล็อกแข็งขึ้น จากนั้นจึงตัดโดยใช้ไมโครโตม จริงอยู่ มีการใช้ไส้ในเนื้อเยื่อพืชน้อยกว่าในสัตว์มาก สิ่งนี้อธิบายได้จากข้อเท็จจริงที่ว่าเซลล์พืชมีผนังเซลล์ที่แข็งแรงซึ่งประกอบเป็นกรอบเนื้อเยื่อ เปลือกอ่อนมีความแข็งแรงเป็นพิเศษ

อย่างไรก็ตาม การเทสามารถทำลายโครงสร้างของเซลล์ได้ ดังนั้นจึงใช้วิธีอื่นเพื่อลดอันตรายนี้ การแช่แข็งอย่างรวดเร็ว ที่นี่คุณสามารถทำได้โดยไม่ต้องแก้ไขและเติม เนื้อเยื่อแช่แข็งถูกตัดโดยใช้ไมโครโตมพิเศษ (ไครโอโตม)

ส่วนแช่แข็งที่เตรียมในลักษณะนี้มีข้อได้เปรียบที่แตกต่างกันในการรักษาลักษณะโครงสร้างตามธรรมชาติได้ดีขึ้น อย่างไรก็ตาม พวกมันปรุงยากกว่า และการปรากฏของผลึกน้ำแข็งยังคงทำลายรายละเอียดบางส่วน

นักจุลทรรศน์มักกังวลอยู่เสมอเกี่ยวกับความเป็นไปได้ที่ส่วนประกอบของเซลล์บางส่วนจะสูญเสียหรือบิดเบี้ยวในระหว่างกระบวนการตรึงและการย้อมสี ดังนั้นผลลัพธ์ที่ได้จึงได้รับการตรวจสอบโดยวิธีอื่น

โอกาสในการศึกษาเซลล์ที่มีชีวิตภายใต้กล้องจุลทรรศน์ดูน่าดึงดูดมาก แต่ในลักษณะที่รายละเอียดของโครงสร้างของพวกมันจะปรากฏชัดเจนยิ่งขึ้น โอกาสนี้มาจากระบบออพติคอลพิเศษ: ความคมชัดของเฟสและ การรบกวนกล้องจุลทรรศน์ เป็นที่ทราบกันดีว่าคลื่นแสงก็เหมือนกับคลื่นน้ำที่สามารถรบกวนซึ่งกันและกัน โดยจะเพิ่มหรือลดความกว้างของคลื่นที่เกิดขึ้นได้ ในกล้องจุลทรรศน์แบบธรรมดา เมื่อคลื่นแสงผ่านแต่ละส่วนประกอบของเซลล์ คลื่นจะเปลี่ยนระยะ แม้ว่าดวงตาของมนุษย์จะไม่สามารถตรวจพบความแตกต่างเหล่านี้ได้ แต่เนื่องจากการรบกวน คลื่นจึงสามารถแปลงได้ จากนั้นจึงแยกส่วนประกอบต่างๆ ของเซลล์ออกจากกันภายใต้กล้องจุลทรรศน์ โดยไม่ต้องพึ่งการย้อมสี กล้องจุลทรรศน์เหล่านี้ใช้ลำแสง 2 ลำที่มีปฏิสัมพันธ์ (ซ้อน) ซึ่งกันและกัน เพื่อเพิ่มหรือลดความกว้างของคลื่นที่เข้าสู่ดวงตาจากส่วนประกอบต่างๆ ของเซลล์

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน

ความสามารถของกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง ดังที่กล่าวไปแล้ว ถูกจำกัดด้วยความยาวคลื่นของแสงที่มองเห็นได้ ความละเอียดสูงสุดประมาณ 0.2 ไมครอน

ความก้าวหน้าครั้งสำคัญเกิดขึ้นในกล้องจุลทรรศน์ในช่วงทศวรรษปี ค.ศ. 1920 เมื่อค้นพบว่าสนามแม่เหล็กไฟฟ้าที่ได้รับการคัดเลือกอย่างเหมาะสมสามารถนำมาใช้เหมือนกับเลนส์ในการโฟกัสลำอิเล็กตรอนได้

ความยาวคลื่นของอิเล็กตรอนจะสั้นกว่าความยาวคลื่นของแสงที่มองเห็นได้มาก และหากใช้อิเล็กตรอนแทนแสง ขีดจำกัดความละเอียดของกล้องจุลทรรศน์จะลดลงอย่างเห็นได้ชัด

จากทั้งหมดนี้ จึงมีการสร้างกล้องจุลทรรศน์ขึ้นโดยใช้ลำแสงอิเล็กตรอนแทนแสง กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนตัวแรกถูกสร้างขึ้นในปี พ.ศ. 2474 โดย Knoll และ Ruska ในประเทศเยอรมนี อย่างไรก็ตาม หลายปีผ่านไปก่อนที่จะสามารถศึกษาส่วนต่างๆ ของเนื้อเยื่อด้วยกล้องจุลทรรศน์นี้ได้ เฉพาะในยุค 50 เท่านั้นที่มีการพัฒนาวิธีการผลิตชิ้นส่วนที่มีคุณสมบัติที่จำเป็น ตั้งแต่นั้นเป็นต้นมา ยุคใหม่ของกล้องจุลทรรศน์ก็เริ่มต้นขึ้น และกระแสข้อมูลเกี่ยวกับโครงสร้างเล็กๆ ของเซลล์ก็หลั่งไหลเข้าสู่วิทยาศาสตร์อย่างแท้จริง (โครงสร้างพิเศษของเซลล์)

ความยากของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนคือจำเป็นต้องมีการประมวลผลพิเศษเพื่อศึกษาตัวอย่างทางชีววิทยา

ปัญหาแรกคืออิเล็กตรอนมีพลังทะลุทะลวงที่จำกัดมาก ดังนั้นจึงจำเป็นต้องเตรียมส่วนที่บางเฉียบซึ่งมีความหนา 50 - 100 นาโนเมตร เพื่อให้ได้ส่วนที่บางดังกล่าว เนื้อเยื่อจะถูกชุบด้วยเรซินก่อน: เรซินจะเกิดปฏิกิริยาโพลีเมอร์เพื่อสร้างบล็อกพลาสติกแข็ง จากนั้นใช้มีดแก้วคมๆ หรือมีดเพชร ตัดส่วนต่างๆ บนไมโครโตมแบบพิเศษ

มีปัญหาอีกอย่างหนึ่งคือเมื่ออิเล็กตรอนผ่านเนื้อเยื่อชีวภาพจะไม่ได้ภาพที่ตัดกัน เพื่อให้ได้ความแตกต่าง ตัวอย่างทางชีวภาพบางส่วนจะถูกชุบด้วยเกลือของโลหะหนัก

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนมีสองประเภทหลัก ใน การแพร่เชื้อกล้องจุลทรรศน์ (ส่ง) ซึ่งเป็นลำแสงอิเล็กตรอนที่ผ่านตัวอย่างที่เตรียมไว้เป็นพิเศษจะทิ้งภาพไว้บนหน้าจอ ความละเอียดของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านสมัยใหม่นั้นมากกว่าความละเอียดของแสงเกือบ 400 เท่า กล้องจุลทรรศน์เหล่านี้มีความละเอียดประมาณ 0.5 นาโนเมตร (สำหรับการเปรียบเทียบ เส้นผ่านศูนย์กลางของอะตอมไฮโดรเจนอยู่ที่ประมาณ 0.1 นาโนเมตร)

แม้จะมีความละเอียดสูง แต่กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านก็มีข้อเสียที่สำคัญ:

ได้รับภาพสามมิติ (ปริมาตร) โดยใช้ การสแกนกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน (EM) ในกรณีนี้ลำแสงจะไม่ผ่านตัวอย่าง แต่จะสะท้อนจากพื้นผิว

ตัวอย่างทดสอบได้รับการแก้ไขและทำให้แห้ง แล้วหุ้มด้วยโลหะบางๆ หรือไม่ การดำเนินการนี้เรียกว่า การแรเงา(ตัวอย่างถูกแรเงา)

ในการสแกน EM ลำแสงอิเล็กตรอนที่โฟกัสจะถูกส่งไปยังตัวอย่างโดยตรง (ตัวอย่างจะถูกสแกน) เป็นผลให้พื้นผิวโลหะของตัวอย่างปล่อยอิเล็กตรอนทุติยภูมิที่มีพลังงานต่ำออกมา จะถูกบันทึกและแปลงเป็นภาพบนหน้าจอโทรทัศน์ ความละเอียดสูงสุดของกล้องจุลทรรศน์สแกนมีขนาดเล็กประมาณ 10 นาโนเมตร แต่ภาพเป็นแบบสามมิติ

วิธีการแช่แข็งชิป

ความเป็นไปได้ใหม่โดยพื้นฐานแล้วของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนเปิดขึ้นค่อนข้างเร็ว ๆ นี้ หลังจากการพัฒนาวิธีการนี้ "แช่แข็ง - บิ่น"เมื่อใช้วิธีการนี้ จะมีการตรวจสอบรายละเอียดที่ดีที่สุดของโครงสร้างเซลล์ และได้ภาพสามมิติจากกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน

ในระหว่างการแช่แข็งตามปกติ ผลึกน้ำแข็งจะก่อตัวในเซลล์ ซึ่งทำให้โครงสร้างของพวกมันบิดเบี้ยวอย่างเห็นได้ชัด เพื่อหลีกเลี่ยงปัญหานี้ เซลล์จะถูกแช่แข็งอย่างรวดเร็วที่อุณหภูมิไนโตรเจนเหลว (- 196 C) ด้วยการแช่แข็งทันที ผลึกน้ำแข็งจะไม่มีเวลาก่อตัว และเซลล์จะไม่เกิดการเสียรูป

บล็อกที่แช่แข็งจะถูกแยกออกด้วยใบมีด (จึงเป็นที่มาของวิธีการ) จากนั้น โดยปกติจะอยู่ในห้องสุญญากาศ น้ำแข็งส่วนเกินจะถูกกำจัดออกโดยการระเหิด การดำเนินการนี้เรียกว่า การแกะสลักหลังจากการแกะสลัก ความโล่งใจในระนาบความแตกแยกจะชัดเจนยิ่งขึ้น ได้รับตัวอย่างแล้ว แรเงา,นั่นคือชั้นโลหะหนักบาง ๆ จะถูกพ่นลงบนพื้นผิวของตัวอย่าง อย่างไรก็ตาม เคล็ดลับก็คือ การสะสมจะเกิดขึ้นที่มุมกับพื้นผิวของตัวอย่าง นี่เป็นจุดที่สำคัญมาก เอฟเฟ็กต์เงาจะปรากฏขึ้นและภาพมีลักษณะเป็นสามมิติ

ในกล้องจุลทรรศน์แบบส่องผ่าน ลำแสงอิเล็กตรอนสามารถทะลุผ่านส่วนที่บางมากเท่านั้น ตัวอย่างที่แรเงามีความหนาตามปกติมากเกินไป ดังนั้นอินทรียวัตถุที่อยู่ใต้ชั้นโลหะจึงต้องถูกละลาย ผลที่ได้คือโลหะบางๆ แบบจำลอง(หรือรอยประทับ) จากพื้นผิวของตัวอย่าง แบบจำลองถูกใช้ในกล้องจุลทรรศน์แบบส่องผ่าน

การหมุนเหวี่ยงแบบดิฟเฟอเรนเชียล

นอกจากการใช้กล้องจุลทรรศน์แล้ว วิธีศึกษาเซลล์ที่สำคัญและแพร่หลายอีกวิธีหนึ่งก็คือ การหมุนเหวี่ยงที่แตกต่างกันหรือ การแยกส่วน

อัตราการตกตะกอน (ทับถม) ของส่วนประกอบแสดงโดยใช้ ค่าสัมประสิทธิ์การตกตะกอนกำหนด ส.

วิธีการเพาะเลี้ยงเซลล์

วิธีการเพาะเลี้ยงเซลล์เอื้อต่อการศึกษากลไกการแยกเซลล์ในพืช

บนอาหารเลี้ยงเซลล์ เซลล์พืชสร้างมวลเซลล์ที่ไม่แตกต่างกันเป็นเนื้อเดียวกันหรือไม่ แคลลัสแคลลัสรักษาด้วยฮอร์โมน ภายใต้อิทธิพลของฮอร์โมน เซลล์แคลลัสสามารถก่อให้เกิดอวัยวะต่างๆ

โครงสร้างและการทำงานของเซลล์พืช

1. โครงสร้างของเซลล์พืช: เยื่อหุ้มเซลลูโลส, พลาสมาเมมเบรน, ไซโตพลาสซึมที่มีออร์แกเนล, นิวเคลียส, แวคิวโอลที่มีน้ำนมจากเซลล์ การมีอยู่ของพลาสติดเป็นคุณสมบัติหลักของเซลล์พืช

2. หน้าที่ของเยื่อหุ้มเซลล์ - ทำให้เซลล์มีรูปร่างปกป้องจากปัจจัยด้านสิ่งแวดล้อม

3. พลาสมาเมมเบรนเป็นฟิล์มบางประกอบด้วยโมเลกุลที่มีปฏิกิริยาโต้ตอบของไขมันและโปรตีน กั้นเนื้อหาภายในจากสภาพแวดล้อมภายนอก ช่วยให้มั่นใจในการขนส่งน้ำ แร่ธาตุ และสารอินทรีย์เข้าสู่เซลล์โดยออสโมซิสและการขนส่งแบบแอคทีฟ และยังกำจัดอีกด้วย ของเสียที่เป็นอันตราย

4. ไซโตพลาสซึมเป็นสภาพแวดล้อมกึ่งของเหลวภายในของเซลล์ซึ่งมีนิวเคลียสและออร์แกเนลตั้งอยู่ ทำหน้าที่เชื่อมโยงระหว่างพวกมัน และมีส่วนร่วมในกระบวนการชีวิตขั้นพื้นฐาน

5. Endoplasmic reticulum - เครือข่ายของช่องทางการแตกแขนงในไซโตพลาสซึม เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์โปรตีน ไขมัน และคาร์โบไฮเดรต และในการขนส่งสาร ไรโบโซมคือร่างกายที่อยู่บน ER หรือในไซโตพลาสซึม ซึ่งประกอบด้วย RNA และโปรตีน และเกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์โปรตีน EPS และไรโบโซมเป็นเครื่องมือเดียวสำหรับการสังเคราะห์และขนส่งโปรตีน

6. ไมโตคอนเดรียเป็นออร์แกเนลล์ที่คั่นด้วยไซโตพลาสซึมด้วยเยื่อหุ้ม 2 ชั้น ในนั้นด้วยการมีส่วนร่วมของเอนไซม์สารอินทรีย์จะถูกออกซิไดซ์และโมเลกุล ATP จะถูกสังเคราะห์ เพิ่มพื้นผิวของเยื่อหุ้มชั้นในซึ่งมีเอนไซม์อยู่เนื่องจากคริสเต ATP เป็นสารอินทรีย์ที่อุดมด้วยพลังงาน

7. พลาสติด (คลอโรพลาสต์, ลิวโคพลาสต์, โครโมพลาสต์) เนื้อหาในเซลล์เป็นคุณสมบัติหลักของสิ่งมีชีวิตพืช คลอโรพลาสต์เป็นพลาสติดที่มีคลอโรฟิลล์เม็ดสีเขียว ซึ่งดูดซับพลังงานแสงและใช้ในการสังเคราะห์สารอินทรีย์จากคาร์บอนไดออกไซด์และน้ำ คลอโรพลาสต์ถูกแยกออกจากไซโตพลาสซึมด้วยเยื่อหุ้มสองอัน ซึ่งมีผลพลอยได้มากมาย - กรานาบนเยื่อหุ้มชั้นในซึ่งมีโมเลกุลคลอโรฟิลล์และเอนไซม์อยู่

8. Golgi complex เป็นระบบของโพรงที่คั่นด้วยไซโตพลาสซึมด้วยเมมเบรน เกิดการสะสมของโปรตีน ไขมัน และคาร์โบไฮเดรตอยู่ในนั้น ดำเนินการสังเคราะห์ไขมันและคาร์โบไฮเดรตบนเยื่อหุ้มเซลล์

9. ไลโซโซมเป็นร่างกายที่คั่นด้วยไซโตพลาสซึมด้วยเยื่อหุ้มเซลล์เดียว เอ็นไซม์ที่บรรจุอยู่เร่งการสลายตัวของโมเลกุลเชิงซ้อนให้เป็นโมเลกุลเชิงเดี่ยว: โปรตีนเป็นกรดอะมิโน, คาร์โบไฮเดรตเชิงซ้อนเป็นโมเลกุลเชิงเดี่ยว, ไขมันเป็นกลีเซอรอลและกรดไขมัน และยังทำลายส่วนที่ตายแล้วของเซลล์และเซลล์ทั้งหมด

10. แวคิวโอล - โพรงในไซโตพลาสซึมที่เต็มไปด้วยเซลล์น้ำนมซึ่งเป็นแหล่งสะสมสารอาหารสำรองและสารอันตราย ควบคุมปริมาณน้ำในเซลล์

11. การรวมเซลล์ - หยดและธัญพืชของสารอาหารสำรอง (โปรตีน ไขมัน และคาร์โบไฮเดรต)

12. นิวเคลียสเป็นส่วนหลักของเซลล์ซึ่งปกคลุมด้านนอกด้วยเยื่อหุ้มนิวเคลียสแบบเมมเบรนสองชั้นที่แทรกซึมอยู่ในรูขุมขน สารเข้าสู่แกนกลางและถูกกำจัดออกจากมันผ่านรูขุมขน โครโมโซมเป็นพาหะของข้อมูลทางพันธุกรรมเกี่ยวกับลักษณะของสิ่งมีชีวิตซึ่งเป็นโครงสร้างหลักของนิวเคลียส ซึ่งแต่ละโมเลกุลประกอบด้วยโมเลกุล DNA หนึ่งโมเลกุลรวมกับโปรตีน นิวเคลียสเป็นที่ตั้งของการสังเคราะห์ DNA, mRNA และ rRNA