Wirowanie w cytologii. Wirowanie strefowe Wirowanie frakcyjne komórek

Leibig (Zig. za S. Granik, 1962) ustalił, że w tkankach merystematycznych żelazo jest niezbędne do syntezy enzymów mitochondrialnych zawierających żelazo; 82% koncentruje się w chloroplastach; jedynie śladowe ilości znaleziono w jądrach. W tym samym czasie A. F. Agafonova, NS Chaplygina (1962), badając wchłanianie żelaza przez rośliny i jego dystrybucję w komórce, doszedł do wniosku, że jądra komórkowe miąższu liści kukurydzy zawierają więcej żelaza niż chloroplasty i struktury typu mitochondrialnego. Zawartość żelaza w tych ostatnich była niższa niż w chloroplastach.
Pewnych danych na temat lokalizacji boru w strukturach komórkowych dostarcza J. Skok (1962). Autorka zwraca uwagę, że mitochondria i mikrosomy zawierają mniej boru niż jądra, plastydy i supernatant. Do realizacji różnych funkcji komórkowych wykorzystuje się bor zawarty w dializowanej frakcji supernatantu.
My wraz z Z.M. Klimovitskaya, L.D. Leydenskaya i E.V. Rudakowej w latach 1961-1953. badali lokalizację pierwiastków śladowych manganu, molibdenu i cynku w strukturach komórkowych roślin oraz zawartość pierwiastków śladowych w związku z ontogenezą roślin. Zastosowano metodę wirowania różnicowego, która umożliwia izolację cytoplazmy i organelli komórkowych: jądra, chloroplastów, mitochondriów. Zastosowaliśmy metodę izolacji struktur komórkowych zaproponowaną przez N.S. Sissakyan, I.M. Mosołowa (1961-1962).
W 1961 roku prowadzono prace w wirówce chłodzonej o łącznej rozdzielczości 30 000 g. Duże fragmenty komórek wyizolowano z homogenatów liści buraka cukrowego (odmiana Verkhnyachskaya 020) w 0,35 M roztworze sacharozy w ilości 2500 g, chloroplastów w ilości 4500 g i mitochondriów w ilości 17 000 g. Oddzielone frakcje spalono. W powstałym popiele oznaczono mangan. Jego zawartość wyrażono w miligramach w przeliczeniu na konkretną frakcję wyizolowaną z 1 kg surowej masy roślinnej. Zatem duże fragmenty komórek zawierały 20,88 mg/kg manganu, czyli 44,5%; w chloroplastach - 3,46 lub 7,5; w mitochondriach - 2,05 lub 4,3; w niezielonych strukturach cytoplazmatycznych – 20,43 mg/kg, czyli 43,7%. Preparaty chloroplastowe identyfikowano na podstawie ich charakterystycznej luminescencji.
Maksymalna ilość manganu zawarta była w niezielonych strukturach cytoplazmatycznych i dużych fragmentach komórek. Przeliczając zawartość manganu w popiele poszczególnych frakcji, maksymalną jego ilość notowano dla frakcji chloroplastów i mitochondriów. Duże fragmenty komórek zawierały 325,1 mg manganu na 100 g popiołu, czyli 16,3%; w chloroplastach - 823,9 lub 42,5; w mitochondriach - 500 lub 25,1; w niezielonych strukturach cytoplazmatycznych - 321 mg, czyli 16,1% manganu.
W 1962 roku przyjęliśmy następującą metodykę badania zawartości manganu, molibdenu i cynku w strukturach komórkowych liści bobiku i buraków cukrowych. Fasola (odmiana Herz-Freya) i buraki cukrowe (odmiana Ramonskaya 04) uprawiane były w gospodarstwie doświadczalnym Instytutu Fizjologii Roślin Akademii Nauk Ukraińskiej SRR na glebie bielicowo-czarnoziemskiej na tle NPK z dodatek manganu, molibdenu i cynku. Na początku, w środku i na końcu sezonu wegetacyjnego pobieraliśmy próbki liści (30 g surowca), następnie mielono je na lodzie z dodatkiem 40 ml 0,5 M sacharozy i 10 ml buforu fosforanowego (wg Sørensena); pH środowiska wynosi 7,1. Powstałe homogenaty poddano wirowaniu różnicowemu w wirówce TM-14 z rozdzielczością 20 000 g. Najpierw z homogenatów usunięto duże fragmenty komórek. Następnie mniejsze fragmenty (fragmenty) komórek izolowano w wirówce przy 1500 i 3000 g przez 10 min. Zauważono, że przy 3000 g jądra osiadały w ciągu 10 minut. Chloroplasty izolowano przez 15 minut przy 6000 - 10 000 g, a mitochondria izolowano przy 14 000 g. Wyodrębnione frakcje poddano wielokrotnemu wirowaniu z 2 ml sacharozy przez 10-15 minut przy odpowiedniej dla każdej frakcji prędkości. Powstałe frakcje spalono w mufli, a w popiele oznaczono mangan, molibden i cynk. Oznaczono także zawartość tych mikroelementów w pozostałym supernatancie.
Frakcje poddano analizie histologicznej. Błony komórkowe, jądra i chloroplasty badano pod mikroskopem. Nie byliśmy w stanie zidentyfikować mitochondriów. Okazało się, że liście fasoli mają bardzo ciężkie elementy; były to głównie chloroplasty, które wytrąciły się prawie całkowicie przy masie 3000-6000 g. Ciecz supernatantu była klarowna. W buraku cukrowym chloroplasty najlepiej sedymentowały przy masie 6000-10 000 g. Nie udało się uzyskać całkowicie przezroczystego supernatantu nawet przy 14 000 g. To w oczywisty sposób wyjaśnia brak jednolitej metody izolowania struktur komórkowych. Różne stopnie sedymentacji struktur komórkowych wymagają zróżnicowanych metod ich izolacji, uwzględniających cechy biologiczne każdej kultury.
Ilość mikroelementów w strukturach komórkowych wyodrębnionych metodą wirowania różnicowego obliczono w miligramach na 1 kg surowca próbki, jako procent całkowitej zawartości oraz w miligramach na 100 g popiołu każdej frakcji.
Ze struktur komórkowych liści buraka cukrowego maksymalna ilość manganu (w przeliczeniu na frakcję wyizolowaną z 1 kg surowca) koncentruje się w cieczy supernatantowej, czyli w cytoplazmie; w dużych fragmentach komórek (chloroplastach, jądrach, mitochondriach) występuje w kolejności malejącej. W połowie sezonu wegetacyjnego ilość manganu w liściach buraka cukrowego (tab. 45) wzrasta ze względu na wzrost jego zawartości w dużych fragmentach komórkowych oraz w płynnym supernatancie. W organellach komórkowych (jądrach, chloroplastach, mitochondriach) utrzymuje się na stałym poziomie przez cały sezon wegetacyjny.

Co to jest wirowanie? Do czego służy metoda? Termin „wirowanie” oznacza rozdzielanie ciekłych lub stałych cząstek substancji na różne frakcje przy użyciu sił odśrodkowych. To oddzielanie substancji odbywa się za pomocą specjalnych urządzeń - wirówek. Jaka jest zasada metody?

Zasada wirowania

Przyjrzyjmy się definicji bardziej szczegółowo. Wirowanie to oddziaływanie na substancje poprzez bardzo szybkie obracanie się w specjalistycznej aparacie. Główną częścią każdej wirówki jest rotor, w którym znajdują się gniazda do montażu probówek z materiałem poddawanym rozdziałowi na osobne frakcje. Kiedy rotor obraca się z dużą prędkością, substancje umieszczone w probówkach rozdzielają się na różne substancje w zależności od poziomu gęstości. Na przykład wirowanie próbek wody gruntowej oddziela ciecz i wytrąca zawarte w niej cząstki stałe.

Autor metody

Po raz pierwszy dowiedziano się, czym jest wirowanie, po eksperymentach przeprowadzonych przez naukowca A.F. Lebiediewa. Metoda została opracowana przez badacza w celu określenia składu wody glebowej. Wcześniej do tych celów stosowano osadzanie cieczy, a następnie oddzielanie od niej próbek stałych. Rozwój metody wirowania umożliwił znacznie szybsze uporanie się z tym zadaniem. Dzięki temu rozdzieleniu możliwa stała się ekstrakcja stałej części substancji z cieczy w postaci suchej w ciągu kilku minut.

Etapy wirowania

Wirowanie różnicowe rozpoczyna się od osadzenia substancji będących przedmiotem badań. Ta obróbka materiału odbywa się w urządzeniach osadniczych. Podczas osiadania cząstki materii oddzielają się pod wpływem grawitacji. Pozwala to na przygotowanie substancji do lepszej separacji przy wykorzystaniu sił odśrodkowych.

Następnie substancje znajdujące się w probówkach są filtrowane. Na tym etapie stosuje się tzw. bębny perforowane, których zadaniem jest oddzielenie cząstek cieczy od cząstek stałych. Podczas przedstawionych czynności cały osad pozostaje na ściankach wirówki.

Zalety metody

W porównaniu do innych metod mających na celu rozdzielenie poszczególnych substancji, takich jak filtracja czy sedymentacja, wirowanie umożliwia uzyskanie osadu o minimalnej zawartości wilgoci. Zastosowanie tej metody separacji pozwala na separację drobnych zawiesin. W rezultacie powstają cząstki o wielkości 5-10 mikronów. Kolejną ważną zaletą wirowania jest możliwość jego wykonania przy użyciu sprzętu o małych objętościach i gabarytach. Jedyną wadą tej metody jest duże zużycie energii przez urządzenia.

Wirowanie w biologii

W biologii rozdział substancji na poszczególne substancje stosuje się, gdy konieczne jest przygotowanie preparatów do badania pod mikroskopem. Wirowanie odbywa się tutaj za pomocą skomplikowanych urządzeń - cytorotorów. Oprócz otworów na probówki, urządzenia takie wyposażone są w uchwyty na próbki i wszelkiego rodzaju szkiełka o skomplikowanej konstrukcji. Konstrukcja wirówki podczas prowadzenia badań z zakresu biologii wpływa bezpośrednio na jakość otrzymywanych materiałów, a co za tym idzie, na ilość przydatnych informacji, jakie można uzyskać z wyników analizy.

Wirowanie w przemyśle rafinacji ropy naftowej

Metoda wirowania jest niezbędna przy produkcji oleju. Istnieją minerały węglowodorowe, z których woda nie jest całkowicie uwalniana podczas destylacji. Wirowanie umożliwia usunięcie nadmiaru płynu z oleju, podnosząc jego jakość. W tym przypadku olej rozpuszcza się w benzenie, następnie podgrzewa do temperatury 60 o C, a następnie poddaje działaniu siły odśrodkowej. Na koniec należy zmierzyć ilość wody pozostałej w substancji i w razie potrzeby powtórzyć procedurę.

Wirowanie krwi

Ta metoda jest szeroko stosowana w celach leczniczych. W medycynie pozwala rozwiązać następującą liczbę problemów:

Pobieranie oczyszczonych próbek krwi do plazmaferezy. W tym celu utworzone elementy krwi oddziela się od osocza w wirówce. Operacja pozwala oczyścić krew z wirusów, nadmiaru przeciwciał, bakterii chorobotwórczych i toksyn.
Przygotowanie krwi do transfuzji dawcy. Po rozdzieleniu płynu ustrojowego na oddzielne frakcje poprzez odwirowanie, krwinki wracają do dawcy, a osocze wykorzystuje się do transfuzji lub zamraża do późniejszego wykorzystania.
Izolacja masy płytek krwi. Substancję otrzymuje się z powstałej masy i stosuje się ją na oddziałach chirurgicznych i hematologicznych instytucji medycznych, w terapii ratunkowej i salach operacyjnych. Zastosowanie masy płytkowej w medycynie umożliwia poprawę krzepliwości krwi u ofiar.
Synteza czerwonych krwinek. Wirowanie krwinek następuje poprzez delikatne oddzielenie ich frakcji, według specjalnej techniki. Gotową masę, bogatą w czerwone krwinki, wykorzystuje się do transfuzji podczas utraty krwi i operacji. Czerwone krwinki są często stosowane w leczeniu anemii i innych ogólnoustrojowych chorób krwi.

We współczesnej praktyce medycznej wykorzystuje się wiele urządzeń nowej generacji, które pozwalają na przyspieszenie obracającego się bębna do określonej prędkości i zatrzymanie go w określonym momencie. Umożliwia to dokładniejszy podział krwi na czerwone krwinki, płytki krwi, osocze, surowicę i skrzepy. W podobny sposób bada się inne płyny ustrojowe, w szczególności oddziela się substancje zawarte w moczu.

Wirówki: główne typy

Dowiedzieliśmy się, czym jest wirowanie. Teraz dowiedzmy się, jakie urządzenia są używane do wdrożenia tej metody. Wirówki mogą być zamknięte lub otwarte, napędzane mechanicznie lub ręcznie. Główną częścią roboczą ręcznych instrumentów otwartych jest oś obrotowa umieszczona pionowo. W jego górnej części znajduje się prostopadle zamocowany pręt, w którym znajdują się ruchome, metalowe tuleje. Zawierają specjalne probówki, które są zwężone u dołu. Na dole rękawów umieszczona jest wata, co pozwala uniknąć uszkodzenia szklanej probówki w przypadku jej kontaktu z metalem. Następnie aparat zostaje wprawiony w ruch. Po pewnym czasie ciecz oddziela się od zawieszonych ciał stałych. Następnie wirówka ręczna zostaje zatrzymana. Na dnie probówek gromadzi się gęsty, stały osad. Powyżej znajduje się ciekła część substancji.

Wirówki mechaniczne typu zamkniętego mają dużą liczbę tulei, w których mieszczą się probówki. Takie urządzenia są wygodniejsze niż ręczne. Ich wirniki napędzane są mocnymi silnikami elektrycznymi i mogą przyspieszyć do 3000 obr./min. Dzięki temu możliwe jest lepsze oddzielenie substancji ciekłych od substancji stałych.

Cechy przygotowania probówek do wirowania

Probówki używane do wirowania należy napełnić materiałem badawczym o jednakowej masie. Dlatego do pomiarów stosuje się tutaj specjalne wagi o wysokiej precyzji. Gdy konieczne jest zrównoważenie wielu probówek w wirówce, stosuje się następującą technikę. Po zważeniu kilku pojemników szklanych i osiągnięciu tej samej masy, jeden z nich pozostaje standardem. Kolejne probówki równoważy się tą próbką przed umieszczeniem ich w aparacie. Technika ta znacznie przyspiesza pracę, gdy konieczne jest przygotowanie całej serii probówek do wirowania.

Warto zaznaczyć, że do probówek nigdy nie umieszcza się zbyt dużej ilości badanej substancji. Pojemniki szklane wypełnia się w taki sposób, aby odległość od krawędzi wynosiła co najmniej 10 mm. W przeciwnym razie substancja wypłynie z probówki pod wpływem siły odśrodkowej.

Superwirówki

Do rozdzielenia składników wyjątkowo cienkich zawiesin nie wystarczy zastosowanie konwencjonalnych wirówek ręcznych lub mechanicznych. W tym przypadku wymagany jest bardziej imponujący wpływ na substancje sił odśrodkowych. Przy realizacji takich procesów stosuje się superwirówki.

Urządzenia przedstawionego planu są wyposażone w ślepy bęben w postaci rury o małej średnicy - nie większej niż 240 mm. Długość takiego bębna znacznie przekracza jego przekrój, co pozwala znacznie zwiększyć liczbę obrotów i wytworzyć potężną siłę odśrodkową.

W superwirówce badana substancja dostaje się do bębna, przemieszcza się przez rurkę i uderza w specjalne reflektory, które wyrzucają materiał na ścianki urządzenia. Istnieją również komory przeznaczone do oddzielnego usuwania cieczy lekkich i ciężkich.

Zalety superwirówek obejmują:

absolutna szczelność;
najwyższa intensywność separacji substancji;
kompaktowe wymiary;
zdolność do rozdzielania substancji na poziomie molekularnym.

Wreszcie

Więc dowiedzieliśmy się, czym jest wirowanie. Obecnie metoda znajduje zastosowanie tam, gdzie zachodzi potrzeba wyodrębnienia osadów z roztworów, oczyszczenia cieczy oraz wydzielenia składników substancji biologicznie czynnych i chemicznych. Ultrawirówki służą do rozdzielania substancji na poziomie molekularnym. Metoda wirowania jest aktywnie stosowana w przemyśle chemicznym, naftowym, nuklearnym, spożywczym, a także w medycynie.

Metoda zamrażania chipów

Zasadniczo nowe możliwości mikroskopii elektronowej otworzyły się stosunkowo niedawno, po opracowaniu metody „zamrażania i rozszczepiania”. Metodą tą badane są najdrobniejsze szczegóły struktury komórki i uzyskiwany trójwymiarowy obraz w transmisyjnym mikroskopie elektronowym.

Podczas normalnego zamrażania w komórkach tworzą się kryształki lodu, które zauważalnie zniekształcają ich strukturę. Aby tego uniknąć, komórki bardzo szybko zamraża się w temperaturze ciekłego azotu (-196°C). Przy tak natychmiastowym zamrożeniu kryształki lodu nie mają czasu na uformowanie się, a komórka nie ulega deformacji.

Zamrożony blok rozłupuje się ostrzem noża (stąd nazwa metody). Następnie, zwykle w komorze próżniowej, nadmiar lodu usuwa się metodą sublimacji. Ta operacja nazywa się trawieniem. Po wytrawieniu relief w płaszczyźnie łupania jest wyraźniejszy. Powstałą próbkę zacienia się, to znaczy na powierzchnię próbki natryskuje się cienką warstwę metali ciężkich. Sztuczka polega jednak na tym, że osadzanie odbywa się pod kątem do powierzchni próbki. To bardzo ważny punkt. Pojawia się efekt cienia, a obraz wygląda trójwymiarowo.

W mikroskopie transmisyjnym wiązka elektronów może przenikać jedynie przez bardzo cienkie fragmenty. Zwykle grubość zacienionych próbek jest nadmierna, dlatego materia organiczna znajdująca się pod warstwą metalu musi zostać rozpuszczona. Rezultatem jest cienka metalowa replika (lub odcisk) powierzchni próbki. Replika jest używana w mikroskopie transmisyjnym.

Metoda ta dała m.in. wyjątkową możliwość obserwacji wewnętrznej struktury błon komórkowych.

Wirowanie różnicowe

Oprócz mikroskopii drugą główną i szeroko stosowaną metodą badania komórek jest wirowanie różnicowe lub frakcjonowanie.

Zasada metody polega na tym, że podczas wirowania powstaje siła odśrodkowa, pod wpływem której zawieszone cząstki osiadają na dnie probówki wirówkowej.

Wraz z wprowadzeniem ultrawirówki na początku lat czterdziestych XX wieku separacja składników komórkowych stała się możliwa.

Przed poddaniem komórek wirowaniu należy je zniszczyć – sztywna rama błon komórkowych musi zostać zniszczona. W tym celu stosuje się różne metody: wibrację ultradźwiękową, przeciskanie przez małe otwory, czy też najczęstsze ucieranie tkanek roślinnych tłuczkiem w porcelanowym moździerzu. Przy ostrożnym stosowaniu metod niszczenia niektóre organelle można zachować w stanie nienaruszonym.

Podczas wirowania z dużą prędkością duże składniki komórek (takie jak jądra) szybko osiadają (osadają) przy stosunkowo niskich prędkościach i tworzą osad na dnie probówki wirówkowej. Przy większych szybkościach wytrącają się mniejsze składniki, takie jak chloroplasty i mitochondria.

Oznacza to, że podczas wirowania składniki komórek rozpadają się na frakcje: dużą i małą, dlatego też druga nazwa metody? frakcjonowanie. Co więcej, im większa prędkość i czas wirowania, tym drobniejsza uzyskana frakcja.

Szybkość sedymentacji (osadzania) składników wyraża się za pomocą współczynnika sedymentacji, oznaczonego S.

Etapy wirowania różnicowego: niska prędkość (jądra, cytoszkielet), średnia prędkość (chloroplasty), duża prędkość (mitochondria, ryzosomy, mikrociała), bardzo duża prędkość (rybosomy).

Frakcjonowane ekstrakty komórkowe, zwane także systemami bezkomórkowymi, są szeroko stosowane do badania procesów wewnątrzkomórkowych. Szczegółowy mechanizm molekularny procesów biologicznych można ustalić jedynie pracując z ekstraktami bezkomórkowymi. Zatem zastosowanie tej szczególnej metody przyniosło triumfalny sukces w badaniach biosyntezy białek.

Cóż, ogólnie rzecz biorąc, czyste frakcje struktur wewnątrzkomórkowych można poddać dowolnemu rodzajowi analizy.

Metoda hodowli komórkowej

Komórki zwierzęce wyizolowane w hodowli (czyli umieszczone na pożywce) po określonej liczbie podziałów obumierają, dlatego uważane są za obiekt trudny i niewygodny w hodowli. Kolejną rzeczą są komórki roślinne, które mogą dzielić się nieograniczoną liczbę razy.

Metoda hodowli komórkowej ułatwia badanie mechanizmów różnicowania komórek u roślin.

Na pożywce komórki roślinne tworzą jednorodną niezróżnicowaną masę komórkową - kalus. Kalus leczy się hormonami. Pod wpływem hormonów z komórek kalusa mogą powstać różne narządy.

Metoda wirowania różnicowego Metoda wirowania różnicowego
do czego służy wirowanie
frakcjonowanie komórek, czyli ich rozdzielanie
zawartość na ułamki w zależności od specyfiki
masa różnych organelli i inkluzji komórkowych.
W wyniku wirowania składniki
komórki wytrącają się z roztworu, osiadając
zgodnie z jego gęstością. Bardziej gęsty
struktury rozliczają się po niższych stawkach
wirowanie, a mniej gęste - na wysokim poziomie
prędkości

1. Nazywa się metoda izolacji organelli z komórek
frakcjonowanie. Ta metoda okazała się bardzo owocna, dająca
biochemikom zdolność do izolowania różnych organelli komórkowych
stosunkowo czysta forma. Pozwala także określić
skład chemiczny organelli i zawarte w nich enzymy
Na podstawie uzyskanych danych wyciągnij wnioski na temat ich funkcji w
klatka szybowa. W pierwszym etapie komórki ulegają zniszczeniu
homogenizację w odpowiednim ośrodku, który
zapewnia bezpieczeństwo organelli i zapobiega ich agregacji.
2. W kolejnym etapie homogenat komórkowy poddawany jest serii
wirowania, każdorazowo z szybkością i czasem trwania
wzrasta; proces ten nazywany jest różnicowaniem
wirowanie. Na dnie odkładają się różne organelle komórkowe
probówki wirówkowe przy różnych prędkościach wirowania,
co zależy od wielkości, gęstości i kształtu organelli.

Etapy wirowania różnicowego:

3. Powstały osad można zebrać i
badania. Te załatwiają się najszybciej
duże i gęste struktury, takie jak jądra, i dla
sedymentacja mniejszych i mniej gęstych
struktury takie jak bąbelki
wymagana siateczka śródplazmatyczna
wyższe prędkości i dłużej
czas. Dlatego przy małych prędkościach
wirowaniu, następuje wytrącenie jąder, oraz
inne organelle komórkowe pozostają
zawieszenia.

Etapy wirowania różnicowego:

4. Przede wszystkim i kiedy wirować
Przy małych (1-3 tys. g) przyspieszeń jądra osiądą i
niezniszczone komórki osiądą przy 15-30 tysiącach g
duże cząstki, makrosomy, składające się z
mitochondria, małe plastydy, peroksysomy, lizosomy
itp., przy 50 tysiącach g mikrosomy i fragmenty opadną
układ wakuolowy komórki.
Opady można zbadać za pomocą
mikroskop elektronowy do określenia czystości
powstałe frakcje. W pewnym stopniu wszystkie frakcje
stopnie są zanieczyszczone innymi organellami. W takim razie
nie mniej możliwe jest osiągnięcie wystarczającej czystości
frakcje, następnie poddaje się je biochemii
analiza w celu określenia składu chemicznego i
aktywność enzymatyczna izolowanych organelli.

Wirowanie w gradiencie gęstości

Niedawno stworzono inną metodę
frakcjonowanie komórek - wirowanie
w gradiencie gęstości; w której
wirowanie przeprowadza się w probówce, w
które wcześniej ułożono jedna na drugiej
roztwory sacharozy o rosnącym stężeniu,
i w konsekwencji zwiększenie gęstości. Na
wirowanie zawarte w homogenacie
organelle znajdują się w probówce wirówkowej
na poziomach, na których znajdują się rozwiązania
sacharoza odpowiadająca im gęstością.

Wykład nr 3.

Liczba godzin: 2

METODY BADAŃ KOMÓRKOWYCH

1. Mikroskopia świetlna

2. Mikroskopia elektronowa, s. 13zalety i wady. Rodzaje mikroskopii elektronowej

Komórki są bardzo małe, a jednocześnie mają złożoną strukturę. Dlatego, aby skutecznie badać budowę i funkcjonowanie komórki, należy znać i opanować odpowiednie metody eksperymentalne.

Na pierwszym etapie rozwoju cytologii jedynym sposobem badania komórek było mikroskopia świetlna.

Mikroskopto urządzenie pozwalające uzyskać w powiększeniu obraz małych obiektów, niewidocznych gołym okiem. W mikroskopii powszechnie stosowane są następujące jednostki długości:

mikrometr (1 µm – 10 -6 m);

nanometr (1 nm – 10 -9 m);

angstrem (1Å – 10 -10 m).

Wyróżnia się mikroskopię świetlną i elektronową. Mikroskop świetlny wykorzystuje światło do wytworzenia powiększonego obrazu, podczas gdy mikroskop elektronowy wykorzystuje strumień elektronów. Jakość obrazu zależy od rozdzielczości mikroskopu. Rozdzielczość to najmniejsza odległość, z której optyka mikroskopu może oddzielnie rozróżnić dwa blisko siebie położone punkty. Rezolucja ludzkie oko ma około 100 mikronów. Oznacza to, że gołym okiem, z odległości 25 cm, obserwator o średniej ostrości wzroku jest w stanie odróżnić jeden punkt od drugiego, jeśli dzieli je odległość co najmniej 100 µm. Jeśli punkty, o których mowa, są od siebie oddalone o mniej niż 100 µm, wydają się być jednym, niewyraźnym punktem. Najlepszy współczesny mikroskop świetlny umożliwia badanie struktur przy odległości między elementami około 0,25 mikrona, mikroskop elektronowy – około 1,5 A.

Mikroskopia świetlna to zestaw metod obserwacji mikroobiektów przy użyciu różnych mikroskopów optycznych. Metody te w istotny sposób zależą od rodzaju soczewki mikroskopu, urządzeń pomocniczych, rodzaju mikroobiektu i sposobu jego przygotowania do obserwacji, a także od charakteru jego oświetlenia podczas obserwacji. Rozdzielczość mikroskopu świetlnego jest ograniczona wymiarami porównywalnymi z długością fali światła (0,4–0,7 μm dla światła widzialnego). Jednak wiele elementów struktury komórkowej ma znacznie mniejsze rozmiary. Ponadto przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu świetlnego większość struktur żywej komórki jest taka optycznie pusty. Struktury optycznie puste to takie, które są przezroczyste i prawie nie różnią się współczynnikiem załamania światła od otaczającego ich środowiska. Opracowano różne metody identyfikacji takich struktur. fiksacja I kolorowanie materiał.

Fiksacjato zabieg, który szybko zakłóca procesy życiowe komórki i w miarę możliwości pozwala zachować strukturę komórek i tkanek w niezmienionym stanie. Po utrwaleniu komórki stają się przepuszczalne dla barwników, ustala się ich położenie i stabilizuje się struktura makrocząsteczek.

Kolorowaniestosowany do optycznego różnicowania struktur komórkowych, a także w badaniach cytochemicznych w celu identyfikacji lokalizacji związków chemicznych. Na przykład barwniki zasadowe (hematoksylina) mają powinowactwo do zawartości jądra, natomiast barwniki kwasowe (eozyna) barwią cytoplazmę. Służy do badania żywych komórek barwniki witalne (dożywotnie).. Barwniki witalne stosunkowo łatwo przenikają do żywych komórek i plamią niektóre struktury, nie uszkadzając ich. Barwniki witalne nie są jednak całkowicie nieszkodliwe dla komórki i przy długotrwałym narażeniu prowadzą do jej śmierci. Barwniki witalne obejmują neutralna czerwień(do barwienia cytoplazmy), błękit metylenowy(barwienie kompleksu Golgiego) itp. Za pomocą barwników życiowych udało się udowodnić istnienie niektórych organelli komórkowych, które wcześniej mylono z artefaktami.

Artefakt- zmiana zachodząca podczas przygotowywania leku.

Przed badaniem komórki lub kawałki tkanki zazwyczaj wlewa się do roztopionej parafiny lub specjalnej żywicy. Medium stosowane do odlewania jest chłodzone lub polimeryzowane. W rezultacie otrzymuje się solidny blok, który jest cięty na bardzo cienkie skrawki za pomocą mikrotomu. Zazwyczaj grubość skrawków do mikroskopii świetlnej wynosi 1-10 µm. Wadą tej metody jest uszkodzenie szeregu struktur komórkowych. Dlatego stosuje się metodę przygotowania skrawków metodą szybkiego zamrażania. Zamrożoną tkankę wycina się na specjalnym mikrotomie (kriotomie) wyposażonym w zimną komorę (kriostat).

Oprócz konwencjonalnej mikroskopii świetlnej komórki bada się przy użyciu mikroskopii ciemnego pola, kontrastu fazowego, fluorescencji i niektórych innych rodzajów mikroskopii świetlnej.

Mikroskopia ciemnego pola. W przeciwieństwie do konwencjonalnego mikroskopu, mikroskop ciemnego pola jest wyposażony w specjalny kondensor. Kondensor posiada ciemną przysłonę, która nie przepuszcza światła do środka pola widzenia, dzięki czemu obiekt oświetlany jest ukośną wiązką. W tym przypadku do soczewki mikroskopu dostają się jedynie promienie odbite i rozproszone od powierzchni obiektu, co zwiększa kontrast niektórych struktur i czyni je widocznymi. Mikroskopia ciemnego pola służy do obserwacji szeregu struktur w żywej komórce. W szczególności mikroskopię ciemnego pola stosuje się do określenia częstotliwości uszkodzeń akrosomów w plemnikach zwierząt hodowlanych.

Mikroskopia z kontrastem fazowym. Mikroskop z kontrastem fazowym został zaprojektowany przez Fritza Zernike'a w 1932 roku. Mikroskopia z kontrastem fazowym jest doskonałą metodą do przyżyciowej obserwacji komórek. Służy do badania wielu organelli komórkowych i chromosomów podczas podziału. Kondensator mikroskopu z kontrastem fazowym ma pierścieniową przysłonę, przez którą światło przechodzi w postaci pustego stożka, a pozostałe promienie są pochłaniane. Obiektyw zawiera płytkę fazową, która jest przezroczystym dyskiem z wycięciem. Kształt i wielkość wycięcia odpowiadają bezpośredniemu obrazowi membrany pierścieniowej. Kiedy przedmiot zostanie umieszczony pomiędzy kondensorem a soczewką w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu, oprócz obrazu bezpośredniego pojawia się kilka nakładających się obrazów dyfrakcyjnych apertury. Nacięcie płytki fazowej oblicza się tak, aby obie wiązki promieni tworzące obraz bezpośredni i dyfrakcyjny różniły się na drodze optycznej o jedną czwartą długości fali. W ten sposób różnice fazowe, które wcześniej były niewidoczne dla oka, przekształcają się w różnice intensywności i stają się widoczne.

Mikroskopia fluorescencyjna jest dobrą metodą obserwacji komórek przyżyciowych. Mikroskop fluorescencyjny pozwala obserwować fluorescencję (świecenie) wielu substancji i struktur komórkowych. Fluorescencja obiektu jest wzbudzana przez promienie ultrafioletowe lub niebieskofioletowe ze specjalnych źródeł światła. Promieniowanie obiektu ma zawsze dłuższą długość fali niż światło ekscytujące. Obiekt oglądany jest w promieniach jego fluorescencji, które są oddzielane od promieni światła ekscytującego za pomocą filtrów świetlnych. Szereg substancji (niektóre witaminy, pigmenty, lipidy) ma swoją własną (pierwotną) fluorescencję. Substancje komórkowe, które nie mają tej właściwości, są wstępnie barwione specjalnymi barwnikami - fluorochromy, a następnie obserwuje się wtórną fluorescencję.

Mikroskopia elektronowa. Mikroskop elektronowy do stworzenia obrazu wykorzystuje strumień elektronów w próżni zamiast światła. Wiązka elektronów skupiana jest nie przez soczewki, jak w mikroskopie świetlnym, ale przez pola elektromagnetyczne. Obraz obserwuje się na ekranie fluorescencyjnym i fotografuje. Obiekty podczas mikroskopii elektronowej znajdują się w głębokiej próżni, dlatego najpierw poddawane są utrwalaniu i specjalnej obróbce. Z tego powodu za pomocą mikroskopu elektronowego można badać wyłącznie komórki martwe. Ponadto muszą być bardzo cienkie, ponieważ przepływ elektronów jest silnie absorbowany przez obiekt. W związku z tym jako obiekty wykorzystuje się ultracienkie skrawki o grubości 20-50 nm umieszczone na najcieńszych foliach. W transmisyjny (transmisyjny) mikroskop elektronowy elektrony przechodzą przez obiekt w taki sam sposób, w jaki światło przechodzi przez niego w mikroskopie świetlnym. Transmisyjna mikroskopia elektronowa służy do badania ultracienkich przekrojów drobnoustrojów, tkanek, a także struktury małych obiektów (wirusy, wici itp.). W skanowanie mikroskopu elektronowego Precyzyjnie skupiona wiązka elektronów porusza się tam i z powrotem po powierzchni próbki. W tym przypadku elektrony odbite od jego powierzchni zbierają się i tworzą obraz. Zaletą stosowania tego typu mikroskopu elektronowego jest to, że tworzy on trójwymiarowy obraz. Dlatego do badania powierzchni obiektów wykorzystuje się skaningową mikroskopię elektronową. Mikroskop elektronowy ma rozdzielczość około 1–2 nm. To wystarczy do badania makrocząsteczek.

Autoriografia. Metoda ta polega na wykorzystaniu substancji znakowanych izotopami promieniotwórczymi. Jeśli do pożywki zostanie dodany izotop radioaktywny i zaabsorbowany przez komórki podczas metabolizmu, jego wewnątrzkomórkową lokalizację można następnie wykryć za pomocą autoradiografii. Dzięki tej metodzie cienkie skrawki komórek umieszcza się na folii. Film ciemnieje pod miejscami, w których znajdują się izotopy promieniotwórcze. Fosfor stosowany jest w postaci izotopów ( P 32), żelazo (Fe 59), siarka (S 35 ), węgiel (C 14), tryt ( H 3) itp.

Wirowanie. Metoda rozpoczęła się w 1926 roku, kiedy Svedberg wynalazł wirówkę analityczną i użył jej do określenia masy cząsteczkowej hemoglobiny. Przed wirowaniem konieczne jest zniszczenie błony komórkowej. Zniszczenie odbywa się za pomocą wibracji ultradźwiękowych, szoku osmotycznego, rozdrabniania i przeciskania przez niewielki otwór. Przy ostrożnym zniszczeniu niektóre organelle komórkowe pozostają nienaruszone. Posiekane tkanki ze zniszczonymi błonami komórkowymi umieszcza się w probówkach i obraca w wirówce z dużą prędkością. Metoda opiera się na fakcie, że różne organelle komórkowe mają różną masę i gęstość. Organelle o większej gęstości osadzane są w probówce przy niskich prędkościach wirowania, a mniej gęste – przy dużych prędkościach. Warstwy te są badane oddzielnie. Zatem jądra i niezniszczone komórki szybko osiadają przy stosunkowo niskich prędkościach i tworzą osad na dnie probówki wirówkowej. Przy wyższych prędkościach mitochondria wytrącają się, a przy jeszcze większych prędkościach i dłuższych okresach wirowania wytrącają się rybosomy. Zazwyczaj takie oczyszczone składniki zachowują wysoką aktywność biochemiczną.

Metoda hodowli komórkowych i tkankowych polega na tym, że z jednej lub kilku komórek na specjalnej pożywce można uzyskać grupę komórek tego samego typu. Metoda ta ma ogromne perspektywy nie tylko dla cytologii, ale także medycyny i rolnictwa. Zatem hodowle komórkowe służą do wyjaśnienia wzorców różnicowania, interakcji komórek ze środowiskiem, adaptacji, starzenia, transformacji itp. W biotechnologii hodowle komórkowe wykorzystuje się do produkcji szczepionek i substancji biologicznie czynnych. W farmakologii służą jako obiekty testowe podczas testowania nowych leków. Twórcą tej metody jest amerykański zoolog i embriolog R. Garrison (1879-1959), któremu w 1907 roku udało się wyhodować komórki salamandry w sztucznym środowisku poza organizmem człowieka. Następnie hodowano wiele rodzajów komórek roślinnych i zwierzęcych in vitro , a metoda ta pozwoliła nam dokonać szeregu ważnych odkryć w dziedzinie fizjologii komórki. Wyrażenie in vitro (łac. „w szkle”) oznacza, że badania przeprowadzono nie na żywym organizmie, ale w takim czy innym naczyniu szklanym. W przeciwieństwie do pierwszego wyrażenia na żywo oznacza eksperyment z całym żywym organizmem. Kultury przygotowane bezpośrednio z tkanek organizmu nazywane są kulturami uprawy pierwotne. W większości przypadków komórki hodowli pierwotnej można przenieść z naczynia hodowlanego i wykorzystać do wytworzenia dużych ilości uprawy wtórne. Linie komórkowe można zastosować do wytworzenia klonów pochodzących z pojedynczej komórki progenitorowej. Można to zrobić fuzja komórkowa jeden lub różne typy. Aby osiągnąć fuzję, komórki poddaje się działaniu enzymów wirusowych lub glikolu polietylenowego. Substancje te uszkadzają błonę plazmatyczną komórek, w wyniku czego powstaje komórka z dwoma oddzielnymi jądrami. Po pewnym czasie taka komórka dzieli się na drodze mitozy, tworząc komórkę hybrydową. W komórce hybrydowej wszystkie chromosomy są połączone w jedno duże jądro. Takie komórki hybrydowe można klonować w celu wytworzenia hybrydowej linii komórkowej. Metodą tą udało się uzyskać komórki hybrydowe człowieka i myszy oraz człowieka i ropuchy. Powstałe komórki hybrydowe są niestabilne i po licznych podziałach komórkowych tracą większość chromosomów jednego lub drugiego typu. Produktem końcowym staje się na przykład zasadniczo komórka myszy, która nie zawiera żadnych ludzkich genów lub zawiera je tylko w śladowych ilościach. Dlatego też technikę tę można z powodzeniem zastosować do mapowania genów w ludzkich chromosomach.

Mikrochirurgia.Metoda ta opiera się na zastosowaniu mikromanipulatorów. Są to urządzenia zapewniające precyzyjne ruchy mikroinstrumentów w klatce. Mikroinstrumenty są zwykle wykonane ze szkła. Ich formę determinują zadania operacji mikrochirurgicznych. Mogą mieć postać igieł, strzykawek, pipet, szpatułek, skalpeli itp. Za pomocą mikromanipulatorów można wykonywać na komórkach różne operacje (wstrzykiwanie substancji do komórek, pobieranie i przeszczepianie jąder, miejscowe uszkodzenia struktur komórkowych itp.). Operacje mikrochirurgiczne sprawdzają się szczególnie dobrze na dużych komórkach (komórkach jednokomórkowych, jajach płazów, komórkach embrionalnych niektórych zwierząt). Zatem komórkę ameby można podzielić na trzy główne składniki - błonę, cytoplazmę i jądro. Elementy te można następnie ponownie złożyć, tworząc żywą komórkę. W ten sposób można uzyskać sztuczne komórki składające się ze składników różnych typów ameb. Operacje mikrochirurgiczne wykonuje się nie tylko za pomocą mikroinstrumentów, ale także za pomocą skupionej wiązki promieni ultrafioletowych (mikroiniekcja wiązki).

Oprócz powyższych metod do badania komórek stosuje się chromatografię, elektroforezę i niektóre inne. Nowe metody poczyniły ogromne postępy w badaniu komórek. Należy jednak pamiętać, że klasyczne metody cytologii, polegające na utrwalaniu, barwieniu i badaniu komórek pod mikroskopem świetlnym, nadal zachowują znaczenie praktyczne.

Wykład 1.

Struktura komórki roślinnej

Mikroskopia świetlna

Mikroskopia elektronowa

Wirowanie różnicowe

Metoda hodowli komórkowej

Komórka jest podstawową jednostką strukturalną i funkcjonalną organizmów żywych.

Komórki embrionalny(niewyspecjalizowane) tkanki zwierząt i roślin pod względem ogólnej budowy są bardzo podobne. To właśnie ta okoliczność była kiedyś przyczyną powstania i rozwoju teorii komórki. Różnice morfologiczne pojawiają się już w zróżnicowanych komórkach wyspecjalizowanych tkanek roślin i zwierząt. Cechy strukturalne komórki roślinnej, podobnie jak całej rośliny, są powiązane ze stylem życia i odżywianiem. Większość roślin prowadzi stosunkowo nieruchomy (przywiązany) tryb życia. Specyfika żywienia roślin polega na tym, że woda i składniki odżywcze: organiczne i nieorganiczne są rozproszone, a roślina musi je pobrać na drodze dyfuzji. Ponadto zielone rośliny w świetle prowadzą autotroficzną metodę odżywiania. Dzięki temu wyewoluowały pewne specyficzne cechy budowy i wzrostu komórek roślinnych. Obejmują one:

	wytrzymały ściana komórkowa polisacharydu, otaczający komórkę i tworzący sztywną ramę;
	układ plastydowy , które powstały w związku z autotroficznym typem odżywiania;
	układ wakuolowy , który w dojrzałych komórkach jest zwykle reprezentowany przez dużą centralną wakuolę, zajmującą do 95% objętości komórki i odgrywającą ważną rolę w utrzymaniu ciśnienie turgorowe;
	specjalny rodzaj wzrostu komórek skręcenia(ze względu na wzrost objętości wakuoli);
	totipotencja , czyli możliwość regeneracji całej rośliny ze zróżnicowanej komórki roślinnej;
	Jest jeszcze jeden szczegół, który odróżnia komórki roślinne od komórek zwierzęcych: w roślinach podczas podziału komórek nie ulegają one ekspresji centriole.

Budowę komórki w jej najbardziej ogólnej postaci znasz z kursu biologii ogólnej i przygotowując się do egzaminów wstępnych dość dobrze przestudiowałeś ten temat. Temat ten jest również omawiany w różnych aspektach na odpowiednich kursach uniwersyteckich (na przykład zoologia bezkręgowców, rośliny niższe). Ponadto bardziej szczegółowe zapoznanie się z komórką na wysokim poziomie odbędzie się na kursie „cytologii”. Ważne jest, abyśmy skupili się na specyficznych cechach strukturalnych komórki roślinnej, głównie komórek rośliny wyższej.

Bardzo powierzchowne badanie struktury typowej komórki roślinnej ujawnia trzy główne elementy: (1) Ściana komórkowa, (2) wakuola, która w dojrzałych komórkach zajmuje centralne miejsce i wypełnia niemal całą ich objętość oraz (3) prototyp, wypychany przez wakuolę na obwód w postaci warstwy ściennej. To właśnie te składniki są wykrywane przy małym powiększeniu mikroskopu świetlnego. Ponadto błona komórkowa i wakuola są produktami życiowej aktywności protoplastu.

Ciało żywej komórki? protoplast składa się z zanurzonych w nim organelli hialoplazma. Organizmy komórkowe obejmują: jądro, plastydy, mitochondria, diktiosomy, retikulum endoplazmatyczne, mikrociała itp. Hialoplazma z organellami bez jądra to cytoplazma komórki.

Aby wyrazić wielkość struktur subkomórkowych, stosuje się pewne miary długości: mikrometr I nanometr.

Mikrometr w układzie jednostek miar SI to wartość równa 10 -6 m . Innymi słowy, mikrometr (w skrócie µm) to 1/1000000 metra i 1/1000 milimetra. 1 µm = 10-6 m . Stara nazwa tej miary mikron.

Nanometr w tym samym układzie reprezentuje milionową część milimetra 1 nm = 10 -9 m i tysięczną mikrometra.

Rozmiar i kształt komórek roślinnych są bardzo zróżnicowane. Zazwyczaj rozmiary komórek roślin wyższych wahają się od 10 do 300 mikronów. To prawda, że \u200b\u200bistnieją komórki olbrzymie, na przykład komórki soczystego miąższu owoców cytrusowych mają kilka milimetrów średnicy lub wyjątkowo długie włókna łykowe pokrzywy osiągają długość 80 mm i mikroskopijną grubość.

Wyróżniają się kształtem izodiametryczny komórki, których wymiary liniowe we wszystkich kierunkach są równe lub nieznacznie się różnią (tzn. długość, szerokość i wysokość tych komórek są porównywalne). Takie komórki nazywane są miąższowymi (miąższ).

Komórki silnie wydłużone, w których długość jest wielokrotnie (czasem setki i tysiące) większa niż wysokość i szerokość, nazywane są prosenchymalnymi (prozenchyma).

Metody badania komórek roślinnych

Opracowano i zastosowano wiele metod badania komórek, których możliwości decydują o poziomie naszej wiedzy w tym zakresie. Postępy w badaniach biologii komórki, w tym najwybitniejsze osiągnięcia ostatnich lat, kojarzą się zwykle z zastosowaniem nowych metod. Dlatego w celu pełniejszego zrozumienia biologii komórki konieczna jest przynajmniej pewna wiedza na temat odpowiednich metod badania komórek.

Mikroskopia świetlna

Najstarszą i zarazem najpowszechniejszą metodą badania komórek jest mikroskopia. Można powiedzieć, że początek badań komórek dał wynalezienie mikroskopu optycznego.

Gołe ludzkie oko ma rozdzielczość około 1/10 mm. Oznacza to, że jeśli spojrzysz na dwie linie oddalone od siebie o mniej niż 0,1 mm, łączą się one w jedną. Aby rozróżnić bliżej położone struktury, stosuje się instrumenty optyczne, takie jak mikroskop.

Ale możliwości mikroskopu świetlnego nie są nieograniczone. Granicę rozdzielczości mikroskopu świetlnego wyznacza długość fali światła, co oznacza, że mikroskopem optycznym można badać jedynie struktury, których minimalne wymiary są porównywalne z długością fali promieniowania świetlnego. Najlepszy mikroskop świetlny ma zdolność rozdzielczą około 0,2 mikrona (lub 200 nm), czyli około 500 razy lepszą niż ludzkie oko. Teoretycznie niemożliwe jest zbudowanie mikroskopu świetlnego o wysokiej rozdzielczości.

Wiele elementów ogniwa ma podobną gęstość optyczną i bez specjalnej obróbki są praktycznie niewidoczne w konwencjonalnym mikroskopie świetlnym. Aby były widoczne, różne barwniki z pewną selektywnością.

Na początku XIX wieku. Pojawiło się zapotrzebowanie na barwniki do barwienia tkanin, co z kolei spowodowało przyspieszony rozwój chemii organicznej. Okazało się, że część z tych barwników barwi także tkanki biologiczne i, co było dość nieoczekiwane, często preferencyjnie wiąże się z określonymi składnikami komórki. Zastosowanie takich selektywnych barwników umożliwia dokładniejsze badanie wewnętrznej struktury komórki. Oto tylko kilka przykładów:

	barwnik hematoksylina barwi niektóre składniki jądra na niebiesko lub fioletowo;
	po przetworzeniu sekwencyjnym floroglucyna a następnie za pomocą kwasu solnego zdrewniałe błony komórkowe stają się wiśniowoczerwone;
	barwnik Sudan III barwi suberyzowane błony komórkowe na różowo;
	Słaby roztwór jodu w jodku potasu powoduje zabarwienie ziaren skrobi na niebiesko.

Do badania mikroskopowego większości tkanek przed barwieniem naprawić. Po utrwaleniu komórki stają się przepuszczalne dla barwników, a struktura komórek zostaje ustabilizowana. Jednym z najpowszechniejszych utrwalaczy w botanice jest alkohol etylowy.

Utrwalanie i barwienie to nie jedyne procedury stosowane w przygotowaniu preparatów. Większość tkanek jest zbyt gruba, aby można je było natychmiast obserwować w wysokiej rozdzielczości. Dlatego wykonuje się cienkie przekroje mikrotom. To urządzenie wykorzystuje zasadę krajalnicy do chleba. Tkanki roślinne wymagają nieco grubszych skrawków niż tkanki zwierzęce, ponieważ komórki roślinne są zazwyczaj większe. Grubość skrawków tkanki roślinnej do mikroskopii świetlnej wynosi około 10 mikronów - 20 mikronów. Niektóre tkanki są zbyt miękkie, aby można je było od razu przyciąć. Dlatego po utrwaleniu wlewa się je do roztopionej parafiny lub specjalnej żywicy, która nasyca całą tkaninę. Po ochłodzeniu tworzy się stały blok, który następnie jest cięty za pomocą mikrotomu. To prawda, że \u200b\u200bwypełnienie stosuje się znacznie rzadziej w przypadku tkanek roślinnych niż w przypadku zwierząt. Wyjaśnia to fakt, że komórki roślinne mają mocne ściany komórkowe, które tworzą szkielet tkanki. Zdrewniałe muszle są szczególnie mocne.

Jednak zalewanie może zaburzyć strukturę ogniwa, więc stosuje się inną metodę, gdzie ryzyko to jest zmniejszone? szybkie zamrażanie. Tutaj możesz obejść się bez mocowania i napełniania. Zamrożoną tkankę wycina się za pomocą specjalnego mikrotomu (kriotom).

Przygotowane w ten sposób przekroje mrożone mają tę wyraźną zaletę, że lepiej zachowują naturalne cechy strukturalne. Są jednak trudniejsze do ugotowania, a obecność kryształków lodu i tak psuje niektóre detale.

Mikroskopiści zawsze byli zaniepokojeni możliwością utraty i zniekształcenia niektórych składników komórek podczas procesu utrwalania i barwienia. Dlatego uzyskane wyniki są weryfikowane innymi metodami.

Możliwość badania żywych komórek pod mikroskopem wydawała się bardzo kusząca, ale w taki sposób, aby szczegóły ich budowy były wyraźniejsze. Taką możliwość dają specjalne układy optyczne: kontrast fazowy I ingerencja mikroskopy. Powszechnie wiadomo, że fale świetlne, podobnie jak fale wodne, mogą się wzajemnie zakłócać, zwiększając lub zmniejszając amplitudę powstałych fal. W konwencjonalnym mikroskopie fale świetlne przechodząc przez poszczególne elementy komórki zmieniają swoją fazę, chociaż ludzkie oko nie jest w stanie wykryć tych różnic. Jednak dzięki interferencji fale można przekształcić, a następnie pod mikroskopem można rozróżnić różne składniki komórki, bez uciekania się do barwienia. Mikroskopy te wykorzystują 2 wiązki fal świetlnych, które oddziałują (nakładają się) na siebie, zwiększając lub zmniejszając amplitudę fal docierających do oka z różnych elementów komórki.

Mikroskopia elektronowa

Jak już wspomniano, możliwości mikroskopu świetlnego są ograniczone długością fali światła widzialnego. Jego maksymalna rozdzielczość wynosi około 0,2 mikrona.

Duży postęp w mikroskopii nastąpił w latach dwudziestych XX wieku, kiedy odkryto, że odpowiednio dobrane pola elektromagnetyczne można wykorzystać podobnie jak soczewki do skupiania wiązek elektronów.

Długość fali elektronu jest znacznie krótsza niż długość fali światła widzialnego, a jeśli zamiast światła zastosuje się elektrony, granica rozdzielczości mikroskopu może zostać zauważalnie zmniejszona.

Na tej podstawie stworzono mikroskop, w którym zamiast światła wykorzystuje się wiązkę elektronów. Pierwszy mikroskop elektronowy skonstruowali w 1931 roku Knoll i Ruska w Niemczech. Jednak minęło wiele lat, zanim stało się możliwe badanie skrawków tkanek za pomocą tego mikroskopu. Dopiero w latach 50. opracowano metody wytwarzania kształtowników o niezbędnych właściwościach. Od tego czasu rozpoczęła się nowa era mikroskopii, a strumień informacji o drobnej strukturze komórek dosłownie wpłynął do nauki. (ultrastruktura komórki).

Trudność mikroskopii elektronowej polega na tym, że do badania próbek biologicznych konieczne jest specjalne przetwarzanie preparatów.

Pierwszą trudnością jest to, że elektrony mają bardzo ograniczoną zdolność penetracji, dlatego należy przygotować ultracienkie skrawki o grubości 50–100 nm. Aby uzyskać tak cienkie skrawki, tkankę najpierw impregnuje się żywicą: żywica polimeryzuje, tworząc twardy blok z tworzywa sztucznego. Następnie za pomocą ostrego noża szklanego lub diamentowego skrawki wycina się na specjalnym mikrotomie.

Jest jeszcze jedna trudność: kiedy elektrony przechodzą przez tkankę biologiczną, nie uzyskuje się obrazu kontrastowego. W celu uzyskania kontrastu cienkie skrawki próbek biologicznych impregnuje się solami metali ciężkich.

Istnieją dwa główne typy mikroskopów elektronowych. W przenoszenie mikroskopie (transmisyjnym), wiązka elektronów przechodząc przez specjalnie przygotowaną próbkę pozostawia swój obraz na ekranie. Rozdzielczość współczesnego transmisyjnego mikroskopu elektronowego jest prawie 400 razy większa niż rozdzielczość światła. Mikroskopy te mają rozdzielczość około 0,5 nm (dla porównania średnica atomu wodoru wynosi około 0,1 nm).

Pomimo tak wysokiej rozdzielczości transmisyjne mikroskopy elektronowe mają poważne wady:

Trójwymiarowy (objętościowy) obraz uzyskuje się za pomocą łów mikroskop elektronowy (EM). Tutaj wiązka nie przechodzi przez próbkę, ale odbija się od jej powierzchni.

Czy badana próbka jest utrwalana i suszona, a następnie pokryta cienką warstwą metalu? operacja nazywa się zacienienie(próbka jest zacieniona).

Podczas skanowania EM skupiona wiązka elektronów jest kierowana na próbkę (próbka jest skanowana). W rezultacie metalowa powierzchnia próbki emituje elektrony wtórne o niskiej energii. Są one rejestrowane i przekształcane w obraz na ekranie telewizora. Maksymalna rozdzielczość mikroskopu skaningowego jest niewielka, około 10 nm, ale obraz jest trójwymiarowy.

Metoda zamrażania chipów

Zasadniczo nowe możliwości mikroskopii elektronowej otworzyły się stosunkowo niedawno, po opracowaniu tej metody „zamrażanie – odpryskiwanie”. Metodą tą badane są najdrobniejsze szczegóły struktury komórki i uzyskiwany trójwymiarowy obraz w transmisyjnym mikroskopie elektronowym.

Podczas normalnego zamrażania w komórkach tworzą się kryształki lodu, które zauważalnie zniekształcają ich strukturę. Aby tego uniknąć, komórki bardzo szybko zamraża się w temperaturze ciekłego azotu (-196 C). Przy tak natychmiastowym zamrożeniu kryształki lodu nie mają czasu na uformowanie się, a komórka nie ulega deformacji.

Zamrożony blok rozłupuje się ostrzem noża (stąd nazwa metody). Następnie, zwykle w komorze próżniowej, nadmiar lodu usuwa się metodą sublimacji. Ta operacja nazywa się akwaforta. Po wytrawieniu relief w płaszczyźnie łupania jest wyraźniejszy. Otrzymana próbka zacieniony, to znaczy, na powierzchnię próbki natryskuje się cienką warstwę metali ciężkich. Sztuczka polega jednak na tym, że osadzanie odbywa się pod kątem do powierzchni próbki. To bardzo ważny punkt. Pojawia się efekt cienia, a obraz wygląda trójwymiarowo.

W mikroskopie transmisyjnym wiązka elektronów może przenikać jedynie przez bardzo cienkie fragmenty. Zwykle grubość zacienionych próbek jest nadmierna, dlatego materia organiczna znajdująca się pod warstwą metalu musi zostać rozpuszczona. Rezultatem jest cienki metal replika(lub odcisk) z powierzchni próbki. Replika jest używana w mikroskopie transmisyjnym.

Metoda ta dała m.in. wyjątkową możliwość obserwacji wewnętrznej struktury błon komórkowych.

Wirowanie różnicowe

Oprócz mikroskopii drugą główną i szeroko rozpowszechnioną metodą badania komórek jest wirowanie różnicowe Lub frakcjonowanie.

Zasada metody polega na tym, że podczas wirowania powstaje siła odśrodkowa, pod wpływem której zawieszone cząstki osiadają na dnie probówki wirówkowej.

Wraz z wprowadzeniem ultrawirówki na początku lat czterdziestych XX wieku separacja składników komórkowych stała się możliwa.

Szybkość sedymentacji (osadzania) składników wyraża się za pomocą współczynnik sedymentacji, wyznaczony S.

Cóż, ogólnie rzecz biorąc, czyste frakcje struktur wewnątrzkomórkowych można poddać dowolnemu rodzajowi analizy.

Metoda hodowli komórkowej

Metoda hodowli komórkowej ułatwia badanie mechanizmów różnicowania komórek u roślin.

Czy na pożywce komórki roślinne tworzą jednorodną, niezróżnicowaną masę komórkową? kostnina. Kalus leczy się hormonami. Pod wpływem hormonów z komórek kalusa mogą powstać różne narządy.

Budowa i funkcjonowanie komórki roślinnej.

1. Budowa komórki roślinnej: błona celulozowa, błona komórkowa, cytoplazma z organellami, jądro, wakuole z sokiem komórkowym. Główną cechą komórki roślinnej jest obecność plastydów.

2. Funkcje błony komórkowej - nadaje komórce kształt, chroni ją przed czynnikami środowiskowymi.

3. Błona komórkowa jest cienką warstwą, składa się z oddziałujących ze sobą cząsteczek lipidów i białek, oddziela zawartość wewnętrzną od środowiska zewnętrznego, zapewnia transport wody, minerałów i substancji organicznych do komórki poprzez osmozę i transport aktywny, a także usuwa szkodliwe produkty odpadowe.

4. Cytoplazma to wewnętrzne półpłynne środowisko komórki, w którym znajduje się jądro i organelle, zapewnia połączenia między nimi i uczestniczy w podstawowych procesach życiowych.

5. Siateczka śródplazmatyczna - sieć rozgałęzionych kanałów w cytoplazmie. Bierze udział w syntezie białek, lipidów i węglowodanów oraz w transporcie substancji. Rybosomy to ciała zlokalizowane w ER lub cytoplazmie, składające się z RNA i białka i biorące udział w syntezie białek. EPS i rybosomy stanowią pojedynczy aparat do syntezy i transportu białek.

6. Mitochondria to organelle oddzielone od cytoplazmy dwiema błonami. W nich przy udziale enzymów utleniają się substancje organiczne i syntetyzują cząsteczki ATP. Zwiększenie powierzchni błony wewnętrznej, na której znajdują się enzymy, z powodu cristae. ATP jest substancją organiczną bogatą w energię.

7. Plastydy (chloroplasty, leukoplasty, chromoplasty), ich zawartość w komórce jest główną cechą organizmu roślinnego. Chloroplasty to plastydy zawierające zielony pigment chlorofil, który pochłania energię świetlną i wykorzystuje ją do syntezy substancji organicznych z dwutlenku węgla i wody. Chloroplasty oddzielone są od cytoplazmy dwiema błonami, licznymi naroślami - graną na wewnętrznej błonie, w której znajdują się cząsteczki chlorofilu i enzymy.

8. Kompleks Golgiego to układ wnęk oddzielonych od cytoplazmy błoną. Akumulacja w nich białek, tłuszczów i węglowodanów. Przeprowadzanie syntezy tłuszczów i węglowodanów na błonach.

9. Lizosomy to ciała oddzielone od cytoplazmy pojedynczą błoną. Zawarte w nich enzymy przyspieszają rozkład cząsteczek złożonych na proste: białek na aminokwasy, węglowodanów złożonych na proste, lipidów na glicerol i kwasy tłuszczowe, a także niszczą martwe części komórki i całe komórki.

10. Wakuole - wgłębienia w cytoplazmie wypełnione sokiem komórkowym, miejsce gromadzenia rezerwowych składników odżywczych i substancji szkodliwych; regulują zawartość wody w komórce.

11. Wtręty komórkowe - krople i ziarenka rezerwowych składników odżywczych (białka, tłuszcze i węglowodany).

12. Jądro to główna część komórki, pokryta na zewnątrz podwójną błoną jądrową przepuszczalną przez pory. Substancje dostają się do rdzenia i są z niego usuwane przez pory. Chromosomy są nośnikami dziedzicznej informacji o cechach organizmu, głównych strukturach jądra, z których każda składa się z jednej cząsteczki DNA połączonej z białkami. Jądro jest miejscem syntezy DNA, mRNA i rRNA.