ცენტრიფუგაცია ციტოლოგიაში. ზონალური ცენტრიფუგაცია ფრაქციული უჯრედის ცენტრიფუგაცია

ლეიბიგმა (ზიგ. S. Granik-ის მიხედვით, 1962) დაადგინა, რომ მერისტემატულ ქსოვილებში რკინა აუცილებელია მიტოქონდრიის რკინის შემცველი ფერმენტების სინთეზისთვის; მისი 82% კონცენტრირებულია ქლოროპლასტებში. ამავე დროს, ა.ფ. აგაფონოვა, ნ.ს. ჩაპლიგინა (1962), შეისწავლა მცენარეების მიერ რკინის შეწოვა და მისი განაწილება უჯრედში, მივიდა დასკვნამდე, რომ სიმინდის ფოთლების პარენქიმის უჯრედის ბირთვები შეიცავს უფრო მეტ რკინას, ვიდრე ქლოროპლასტები და მიტოქონდრიული ტიპის სტრუქტურები. ამ უკანასკნელში რკინის შემცველობა უფრო დაბალი იყო, ვიდრე ქლოროპლასტებში.
J. Skok-ის (1962) ნაშრომში მოცემულია გარკვეული მონაცემები ბორის ლოკალიზაციის შესახებ ფიჭურ სტრუქტურებში. ავტორი აღნიშნავს, რომ მიტოქონდრია და მიკროზომები შეიცავს ნაკლებ ბორს, ვიდრე ბირთვები, პლასტიდები და სუპერნატანტები. სხვადასხვა უჯრედული ფუნქციების შესასრულებლად გამოიყენება ბორი, რომელიც შეიცავს სუპერნატანტის დიალიზებულ ფრაქციას.
ჩვენ, ზ.მ. კლიმოვიცკაია, ლ.დ. ლეიდენსკაია და ე.ვ. რუდაკოვა 1961-1953 წლებში. შეისწავლა მანგანუმის, მოლიბდენის და თუთიის მიკროელემენტების ლოკალიზაცია მცენარეთა უჯრედულ სტრუქტურებში, აგრეთვე კვალი ელემენტების შემცველობა მცენარეთა ონტოგენეზთან დაკავშირებით. გამოყენებული იქნა დიფერენციალური ცენტრიფუგაციის მეთოდი, რომელიც შესაძლებელს ხდის უჯრედის ციტოპლაზმისა და ორგანელების იზოლირებას: ბირთვი, ქლოროპლასტი, მიტოქონდრია. ჩვენ მივყვეთ უჯრედული სტრუქტურების იზოლირების მეთოდს, რომელიც შემოთავაზებულია N.S. სისაკიანი, ი.მ. მოსოლოვა (1961-1962 წწ.).
1961 წელს მუშაობა ჩატარდა მაცივარ ცენტრიფუგაში, საერთო გარჩევადობით 30000 გ. უჯრედების დიდი ფრაგმენტები იზოლირებული იქნა შაქრის ჭარხლის ფოთლების ჰომოგენატებისგან (ჯიში Verkhnyachskaya 020) 0,35 M საქაროზის ხსნარში 2500 გ, ქლოროპლასტები 4500 გ და მიტოქონდრია 17000 გ. გამოყოფილი ფრაქციები დაიწვა. მიღებულ ნაცარში მანგანუმი განისაზღვრა. მისი შემცველობა გამოხატული იყო მილიგრამებში 1 კგ ნედლი მცენარეული მასალისგან გამოყოფილი კონკრეტული ფრაქციის მიხედვით. ამრიგად, უჯრედის დიდი ფრაგმენტები შეიცავდა 20,88 მგ/კგ მანგანუმს, ანუ 44,5%-ს; ქლოროპლასტებში - 3,46, ანუ 7,5; მიტოქონდრიებში - 2,05, ანუ 4,3; არამწვანე ციტოპლაზმურ სტრუქტურებში - 20,43 მგ/კგ, ანუ 43,7%. ქლოროპლასტის პრეპარატები გამოვლინდა მათი დამახასიათებელი ლუმინესცენციით.
მანგანუმის მაქსიმალურ რაოდენობას შეიცავდა არამწვანე ციტოპლაზმური სტრუქტურები და დიდი უჯრედის ფრაგმენტები. თითოეული ფრაქციის ნაცარში მანგანუმის შემცველობის ხელახალი გაანგარიშებისას მისი მაქსიმალური რაოდენობა აღინიშნა ქლოროპლასტისა და მიტოქონდრიის ფრაქციისთვის. უჯრედის დიდი ფრაგმენტები შეიცავდა 325,1 მგ მანგანუმს 100 გრ ნაცარზე, ანუ 16,3%; ქლოროპლასტებში - 823,9, ანუ 42,5; მიტოქონდრიებში - 500, ანუ 25,1; არამწვანე ციტოპლაზმურ სტრუქტურებში - 321 მგ, ანუ 16,1%, მანგანუმი.
1962 წელს მივიღეთ შემდეგი მეთოდოლოგია მანგანუმის, მოლიბდენის და თუთიის შემცველობის შესასწავლად ფაბას ლობიოსა და შაქრის ჭარხლის ფოთლების უჯრედულ სტრუქტურებში. ლობიო (ჯიში Herz-Freya) და შაქრის ჭარხალი (ჯიში Ramonskaya 04) გაიზარდა უკრაინის სსრ მეცნიერებათა აკადემიის მცენარეთა ფიზიოლოგიის ინსტიტუტის ექსპერიმენტულ ფერმის სადგურზე მდელოს ჩერნოზემიურ პოდზოლიზებულ ნიადაგზე NPK ფონის მიხედვით. მანგანუმის, მოლიბდენის და თუთიის დამატება. ვეგეტაციის დასაწყისში, შუა და ბოლოს ავიღეთ ფოთლების ნიმუშები (30 გრ ნედლეული), შემდეგ ყინულზე დავფქვათ 40 მლ 0,5 მ საქაროზა და 10 მლ ფოსფატის ბუფერი (Sørensen-ის მიხედვით); გარემოს pH არის 7.1. შედეგად მიღებული ჰომოგენატები დაექვემდებარა დიფერენციალურ ცენტრიფუგას TM-14 ცენტრიფუგაზე 20000 გ გარჩევადობით. პირველ რიგში, დიდი უჯრედის ფრაგმენტები ამოიღეს ჰომოგენატებიდან. შემდეგ უჯრედების უფრო მცირე ფრაგმენტები (ფრაგმენტები) იზოლირებული იყო ცენტრიფუგაში 1500 და 3000 გ 10 წუთის განმავლობაში. აღინიშნა, რომ 3000 გ-ზე, ბირთვები 10 წუთში დასახლდა. ქლოროპლასტები იზოლირებული იყო 15 წუთის განმავლობაში 6000 - 10000 გ-ზე, ხოლო მიტოქონდრია იზოლირებული იყო 14000 გ-ზე. იზოლირებული ფრაქციები ექვემდებარებოდნენ განმეორებით ცენტრიფუგას 2 მლ საქაროზასთან ერთად 10-15 წუთის განმავლობაში თითოეული ფრაქციის შესაბამისი სიჩქარით. მიღებულ ფრაქციებს მაფლეში წვავდნენ, ნაცარში კი მანგანუმი, მოლიბდენი და თუთია დაადგინეს. ამ მიკროელემენტების შემცველობა ასევე განისაზღვრა დარჩენილ სუპერნატანში.
ფრაქციები დაექვემდებარა ჰისტოლოგიურ ანალიზს. მიკროსკოპით შეისწავლეს უჯრედის მემბრანები, ბირთვები და ქლოროპლასტები. ჩვენ ვერ შევძელით მიტოქონდრიების იდენტიფიცირება. ლობიოს ფოთლებს ძალიან მძიმე ფორმის ელემენტები ჰქონდა; ეს იყო უპირატესად ქლოროპლასტები, რომლებიც თითქმის მთლიანად ნალექი იყო 3000-6000 გ. ზედაპირული სითხე გამჭვირვალე იყო. შაქრის ჭარხალში ქლოროპლასტები საუკეთესოდ იყო დალექილი 6000-10000 გ. სრულიად გამჭვირვალე ზენატანის მიღება 14000 გ-ზეც კი ვერ მოხერხდა. ეს აშკარად ხსნის უჯრედული სტრუქტურების იზოლირების ერთიანი მეთოდის არარსებობას. უჯრედული სტრუქტურების დალექვის სხვადასხვა ხარისხი მოითხოვს მათი იზოლაციის დიფერენცირებულ მეთოდებს, თითოეული კულტურის ბიოლოგიური მახასიათებლების გათვალისწინებით.
მიკროელემენტების რაოდენობა უჯრედულ სტრუქტურებში, რომლებიც იზოლირებულია დიფერენციალური ცენტრიფუგაციით, გამოითვლებოდა მილიგრამებში ნიმუშის 1 კგ ნედლეულზე, მთლიანი შემცველობის პროცენტულად და მილიგრამებში თითოეული ფრაქციის 100 გ ნაცარზე.
შაქრის ჭარხლის ფოთლების უჯრედული სტრუქტურებიდან მანგანუმის მაქსიმალური რაოდენობა (როდესაც გამოითვლება 1 კგ ნედლეულისგან გამოყოფილ ფრაქციაზე) კონცენტრირებულია ზენატან სითხეში, ანუ ციტოპლაზმაში; უჯრედის მსხვილ ფრაგმენტებში (ქლოროპლასტები, ბირთვები, მიტოქონდრიები) ის შეიცავს კლებადობით. მზარდი სეზონის შუა პერიოდში შაქრის ჭარხლის ფოთლებში მანგანუმის რაოდენობა იზრდება (ცხრილი 45) მისი შემცველობის გაზრდის გამო დიდ უჯრედულ ფრაგმენტებში და ზედმეტ სითხეში. უჯრედის ორგანელებში (ბირთვები, ქლოროპლასტები, მიტოქონდრია) ის საკმაოდ მუდმივი რჩება მთელი მზარდი სეზონის განმავლობაში.

რა არის ცენტრიფუგაცია? რისთვის გამოიყენება მეთოდი? ტერმინი "ცენტრიფუგაცია" ნიშნავს ნივთიერების თხევადი ან მყარი ნაწილაკების სხვადასხვა ფრაქციებად დაყოფას ცენტრიდანული ძალების გამოყენებით. ნივთიერებების ეს გამოყოფა ხორციელდება სპეციალური მოწყობილობების - ცენტრიფუგების გამოყენებით. რა არის მეთოდის პრინციპი?

ცენტრიფუგაციის პრინციპი

მოდით შევხედოთ განმარტებას უფრო დეტალურად. ცენტრიფუგაცია არის ზემოქმედება ნივთიერებებზე სპეციალიზებულ აპარატში ულტრა მაღალი სიჩქარით ბრუნვის გზით. ნებისმიერი ცენტრიფუგის ძირითადი ნაწილია როტორი, რომელიც შეიცავს ბუდეებს საცდელი მილების დასაყენებლად მასალასთან, რომელიც ექვემდებარება განცალკევებას ცალკეულ ფრაქციებად. როდესაც როტორი ბრუნავს მაღალი სიჩქარით, საცდელ მილებში მოთავსებული ნივთიერებები იყოფა სხვადასხვა ნივთიერებებად სიმკვრივის დონის მიხედვით. მაგალითად, მიწისქვეშა წყლების ნიმუშების ცენტრიფუგირება გამოყოფს სითხეს და აგროვებს მასში შემავალ მყარ ნაწილაკებს.

მეთოდის ავტორი

პირველად ცნობილი გახდა რა არის ცენტრიფუგაცია მეცნიერ A.F. Lebedev-ის მიერ ჩატარებული ექსპერიმენტების შემდეგ. მეთოდი შეიმუშავა მკვლევარმა ნიადაგის წყლის შემადგენლობის დასადგენად. ადრე ამ მიზნებისათვის გამოიყენებოდა სითხის დასახლება მისგან მყარი ნიმუშების შემდგომი გამოყოფით. ცენტრიფუგაციის მეთოდის შემუშავებამ შესაძლებელი გახადა ამ ამოცანის უფრო სწრაფად გამკლავება. ამ განცალკევების წყალობით შესაძლებელი გახდა ნივთიერებების მყარი ნაწილის ამოღება თხევადიდან მშრალი სახით რამდენიმე წუთში.

ცენტრიფუგაციის ეტაპები

დიფერენციალური ცენტრიფუგაცია იწყება იმ ნივთიერებების დასახლებით, რომლებიც ექვემდებარება კვლევას. ამ მასალის დამუშავება ხდება დასახლების მოწყობილობებში. დნობისას მატერიის ნაწილაკები გამოიყოფა გრავიტაციის გავლენით. ეს საშუალებას გაძლევთ მოამზადოთ ნივთიერებები უკეთესი განცალკევებისთვის ცენტრიდანული ძალების გამოყენებით.

შემდეგ, საცდელ მილებში არსებული ნივთიერებები იფილტრება. ამ ეტაპზე გამოიყენება ე.წ. წარმოდგენილი აქტივობების დროს მთელი ნალექი რჩება ცენტრიფუგის კედლებზე.

მეთოდის უპირატესობები

სხვა მეთოდებთან შედარებით, რომლებიც მიზნად ისახავს ცალკეული ნივთიერებების განცალკევებას, როგორიცაა ფილტრაცია ან დალექვა, ცენტრიფუგაცია შესაძლებელს ხდის მინიმალური ტენიანობის მქონე ნალექის მიღებას. ამ განცალკევების მეთოდის გამოყენება იძლევა წვრილფეხა სუსპენზიების გამოყოფის საშუალებას. შედეგი არის 5-10 მიკრონი ზომის ნაწილაკების წარმოება. ცენტრიფუგაციის კიდევ ერთი მნიშვნელოვანი უპირატესობა არის მისი შესრულების შესაძლებლობა მცირე მოცულობისა და ზომების აღჭურვილობის გამოყენებით. მეთოდის ერთადერთი ნაკლი არის მოწყობილობების მაღალი ენერგიის მოხმარება.

ცენტრიფუგაცია ბიოლოგიაში

ბიოლოგიაში ნივთიერებების ცალკეულ ნივთიერებებად გამოყოფას მიმართავენ, როდესაც საჭიროა მიკროსკოპის ქვეშ გამოკვლევისთვის პრეპარატების მომზადება. ცენტრიფუგაცია აქ ტარდება რთული მოწყობილობების - ციტოროტორების გამოყენებით. საცდელი მილების სლოტების გარდა, ასეთი მოწყობილობები აღჭურვილია ნიმუშის დამჭერებით და რთული დიზაინის ყველა სახის სლაიდებით. ბიოლოგიაში კვლევის ჩატარებისას ცენტრიფუგის დიზაინი პირდაპირ გავლენას ახდენს მიღებული მასალების ხარისხზე და, შესაბამისად, სასარგებლო ინფორმაციის რაოდენობაზე, რომელიც შეიძლება შეგროვდეს ანალიზის შედეგებიდან.

ცენტრიფუგაცია ნავთობგადამამუშავებელ ინდუსტრიაში

ცენტრიფუგაციის მეთოდი შეუცვლელია ნავთობის წარმოებაში. არსებობს ნახშირწყალბადის მინერალები, საიდანაც წყალი სრულად არ გამოიყოფა დისტილაციის დროს. ცენტრიფუგაცია შესაძლებელს ხდის ზეთიდან ზედმეტი სითხის ამოღებას, გაზრდის მის ხარისხს. ამ შემთხვევაში ზეთი იხსნება ბენზოლში, შემდეგ თბება 60 o C-მდე და შემდეგ ექვემდებარება ცენტრიდანულ ძალას. ბოლოს გაზომეთ ნივთიერებაში დარჩენილი წყლის რაოდენობა და საჭიროების შემთხვევაში გაიმეორეთ პროცედურა.

სისხლის ცენტრიფუგაცია

ეს მეთოდი ფართოდ გამოიყენება სამკურნალო მიზნებისთვის. მედიცინაში ის საშუალებას გაძლევთ გადაჭრას შემდეგი რიგი პრობლემები:

გაწმენდილი სისხლის ნიმუშების მიღება პლაზმაფერეზისთვის. ამ მიზნით, სისხლის წარმოქმნილი ელემენტები გამოყოფილია მისი პლაზმიდან ცენტრიფუგაში. ოპერაცია შესაძლებელს ხდის სისხლის განთავისუფლებას ვირუსებისგან, ჭარბი ანტისხეულებისგან, პათოგენური ბაქტერიებისა და ტოქსინებისგან.
სისხლის მომზადება დონორის ტრანსფუზიისთვის. მას შემდეგ, რაც სხეულის სითხე გამოიყოფა ცალკეულ ფრაქციებად ცენტრიფუგირებით, სისხლის უჯრედები უბრუნდება დონორს და პლაზმა გამოიყენება ტრანსფუზიისთვის ან გაყინული შემდგომი გამოყენებისთვის.
თრომბოციტების მასის იზოლაცია. ნივთიერება მიიღება მიღებული მასისგან და გამოიყენება სამედიცინო დაწესებულებების ქირურგიულ და ჰემატოლოგიურ განყოფილებებში, გადაუდებელ თერაპიასა და საოპერაციო ოთახებში. თრომბოციტების მასის გამოყენება მედიცინაში შესაძლებელს ხდის დაზარალებულებში სისხლის შედედების გაუმჯობესებას.
სისხლის წითელი უჯრედების სინთეზი. სისხლის უჯრედების ცენტრიფუგაცია ხდება მისი ფრაქციების დელიკატური გამოყოფით სპეციალური ტექნიკის მიხედვით. მზა მასა, მდიდარია სისხლის წითელი უჯრედებით, გამოიყენება ტრანსფუზიისთვის სისხლის დაკარგვისა და ოპერაციების დროს. სისხლის წითელი უჯრედები ხშირად გამოიყენება ანემიისა და სისხლის სხვა სისტემური დაავადებების სამკურნალოდ.

თანამედროვე სამედიცინო პრაქტიკაში გამოიყენება მრავალი ახალი თაობის მოწყობილობა, რომელიც შესაძლებელს ხდის მბრუნავი ბარაბნის აჩქარებას გარკვეულ სიჩქარემდე და მის გაჩერებას გარკვეულ მომენტში. ეს საშუალებას აძლევს სისხლს უფრო ზუსტად გამოიყოს სისხლის წითელ უჯრედებად, თრომბოციტებად, პლაზმაში, შრატში და თრომბებად. სხეულის სხვა სითხეების გამოკვლევაც ანალოგიურად ხდება, კერძოდ, შარდში არსებული ნივთიერებების გამოყოფა ხდება.

ცენტრიფუგები: ძირითადი ტიპები

ჩვენ გავარკვიეთ რა არის ცენტრიფუგაცია. ახლა მოდით გავარკვიოთ, რა მოწყობილობები გამოიყენება მეთოდის განსახორციელებლად. ცენტრიფუგა შეიძლება იყოს დახურული ან ღია, მექანიკურად ან ხელით. ხელის ღია ინსტრუმენტების ძირითადი სამუშაო ნაწილი არის მბრუნავი ღერძი, რომელიც მდებარეობს ვერტიკალურად. მის ზედა ნაწილში არის პერპენდიკულარულად დამაგრებული ზოლი, სადაც მოძრავი ლითონის ყდისებია განთავსებული. ისინი შეიცავს სპეციალურ საცდელ მილებს, რომლებიც ვიწროვდება ბოლოში. ბამბის ბამბა მოთავსებულია ყდის ქვედა ნაწილში, რაც თავიდან აიცილებს მინის სინჯარის დაზიანებას მეტალთან შეხებისას. შემდეგი, მოწყობილობა მოძრაობს. გარკვეული პერიოდის შემდეგ, სითხე გამოყოფილია შეჩერებული მყარისაგან. ამის შემდეგ, ხელით ცენტრიფუგა შეჩერებულია. მკვრივი, მყარი ნალექი კონცენტრირებულია საცდელი მილების ბოლოში. მის ზემოთ არის ნივთიერების თხევადი ნაწილი.

დახურული ტიპის მექანიკურ ცენტრიფუგას აქვს დიდი რაოდენობით სამაჯური ტესტი მილების მოსათავსებლად. ასეთი მოწყობილობები უფრო მოსახერხებელია, ვიდრე ხელით. მათი როტორები ამოძრავებს მძლავრი ელექტროძრავებით და შეუძლია აჩქარდეს 3000 rpm-მდე. ეს შესაძლებელს ხდის თხევადი ნივთიერებების უკეთეს გამოყოფას მყარიდან.

ცენტრიფუგისთვის მილების მომზადების თავისებურებები

ცენტრიფუგისთვის გამოყენებული საცდელი მილები ივსება იდენტური მასის საცდელი მასალით. ამიტომ აქ გაზომვისთვის გამოიყენება სპეციალური მაღალი სიზუსტის სასწორები. როდესაც საჭიროა მრავალი მილის დაბალანსება ცენტრიფუგაში, გამოიყენება შემდეგი ტექნიკა. შუშის წყვილი ჭურჭლის აწონვის და იგივე მასის მიღწევის შემდეგ სტანდარტად რჩება ერთი. შემდგომი მილები დაბალანსებულია ამ ნიმუშთან აპარატში მოთავსებამდე. ეს ტექნიკა მნიშვნელოვნად აჩქარებს მუშაობას, როდესაც საჭიროა ცენტრიფუგაციისთვის მილების მთელი სერიის მომზადება.

აღსანიშნავია, რომ საცდელი ნივთიერების ძალიან დიდი რაოდენობა არასოდეს თავსდება სინჯარებში. შუშის კონტეინერები ივსება ისე, რომ მანძილი კიდემდე იყოს მინიმუმ 10 მმ. წინააღმდეგ შემთხვევაში, ნივთიერება ცენტრიდანული ძალის გავლენით გამოვა საცდელი მილიდან.

სუპერცენტრიფუგები

უკიდურესად თხელი სუსპენზიების კომპონენტების გამოსაყოფად, საკმარისი არ არის ჩვეულებრივი სახელმძღვანელო ან მექანიკური ცენტრიფუგების გამოყენება. ამ შემთხვევაში საჭიროა უფრო შთამბეჭდავი ეფექტი ცენტრიდანული ძალების ნივთიერებებზე. ასეთი პროცესების განხორციელებისას გამოიყენება სუპერცენტრიფუგები.

წარმოდგენილი გეგმის მოწყობილობები აღჭურვილია ბრმა ბარაბანით მცირე დიამეტრის მილის სახით - არაუმეტეს 240 მმ. ასეთი ბარაბნის სიგრძე მნიშვნელოვნად აღემატება მის კვეთას, რაც შესაძლებელს ხდის მნიშვნელოვნად გაზარდოს რევოლუციების რაოდენობა და შექმნას ძლიერი ცენტრიდანული ძალა.

სუპერცენტრიფუგაში შესამოწმებელი ნივთიერება შედის ბარაბანში, მოძრაობს მილის მეშვეობით და ურტყამს სპეციალურ რეფლექტორებს, რომლებიც მასალას აგდებენ მოწყობილობის კედლებზე. ასევე არის კამერები, რომლებიც განკუთვნილია მსუბუქი და მძიმე სითხეების ცალკე მოცილებისთვის.

სუპერცენტრიფუგების უპირატესობებში შედის:

აბსოლუტური შებოჭილობა;
ნივთიერების გამოყოფის უმაღლესი ინტენსივობა;
კომპაქტური ზომები;
მოლეკულურ დონეზე ნივთიერებების გამოყოფის უნარი.

ბოლოს და ბოლოს

ასე რომ, ჩვენ გავარკვიეთ რა არის ცენტრიფუგაცია. ამჟამად, მეთოდი პოულობს თავის გამოყენებას, როდესაც საჭიროა ხსნარებიდან ნალექების იზოლირება, სითხეების გაწმენდა და ბიოლოგიურად აქტიური და ქიმიური ნივთიერებების კომპონენტების ცალკეული გამოყოფა. ულტრაცენტრიფუგები გამოიყენება ნივთიერებების მოლეკულურ დონეზე განცალკევებისთვის. ცენტრიფუგაციის მეთოდი აქტიურად გამოიყენება ქიმიურ, ნავთობის, ბირთვულ, კვების მრეწველობაში, ასევე მედიცინაში.

გაყინვა-ჩიპის მეთოდი

ფუნდამენტურად ახალი შესაძლებლობები ელექტრონული მიკროსკოპისთვის გაიხსნა შედარებით ცოტა ხნის წინ, „გაყინვა-გაწყვეტის“ მეთოდის შემუშავების შემდეგ. ამ მეთოდის გამოყენებით, უჯრედის სტრუქტურის საუკეთესო დეტალები შეისწავლება და სამგანზომილებიანი გამოსახულება მიიღება გადამცემ ელექტრონულ მიკროსკოპში.

ნორმალური გაყინვის დროს უჯრედებში წარმოიქმნება ყინულის კრისტალები, რომლებიც შესამჩნევად ამახინჯებენ მათ სტრუქტურას. ამის თავიდან ასაცილებლად უჯრედები ძალიან სწრაფად იყინება თხევადი აზოტის ტემპერატურაზე (-196C). ასეთი მყისიერი გაყინვით, ყინულის კრისტალებს არ აქვთ დრო, რომ ჩამოყალიბდნენ და უჯრედი არ განიცდის დეფორმაციას.

გაყინული ბლოკი იყოფა დანის პირით (აქედან მომდინარეობს მეთოდის სახელი). შემდეგ, ჩვეულებრივ, ვაკუუმურ კამერაში, ჭარბი ყინული ამოღებულია სუბლიმაციით. ამ ოპერაციას ეტიკირება ეწოდება. აკრავის შემდეგ უფრო მკაფიოდ არის განსაზღვრული რელიეფი გაყოფის სიბრტყეში. შედეგად მიღებული ნიმუში დაჩრდილულია, ანუ მძიმე მეტალების თხელი ფენა იფრქვევა ნიმუშის ზედაპირზე. თუმცა, ხრიკი ის არის, რომ დეპონირება ხორციელდება ნიმუშის ზედაპირის კუთხით. ეს ძალიან მნიშვნელოვანი პუნქტია. ჩნდება ჩრდილის ეფექტი და გამოსახულება გამოიყურება სამგანზომილებიანი.

გადამცემ მიკროსკოპში ელექტრონის სხივს შეუძლია შეაღწიოს მხოლოდ ძალიან თხელ მონაკვეთებში. დაჩრდილული ნიმუშების ჩვეულებრივი სისქე გადაჭარბებულია, ამიტომ ლითონის ფენის საფუძვლიანი ორგანული ნივთიერებები უნდა დაიშალა. შედეგი არის ნიმუშის ზედაპირის თხელი ლითონის რეპლიკა (ან ანაბეჭდი). რეპლიკა გამოიყენება გადამცემ მიკროსკოპში.

ეს მეთოდი იძლევა, მაგალითად, უნიკალურ შესაძლებლობას დაკვირვებოდა უჯრედის მემბრანების შიდა სტრუქტურას.

დიფერენციალური ცენტრიფუგაცია

გარდა მიკროსკოპისა, უჯრედების შესწავლის სხვა ძირითადი და ფართოდ გავრცელებული მეთოდია დიფერენციალური ცენტრიფუგაცია ან ფრაქციაცია.

მეთოდის პრინციპი მდგომარეობს იმაში, რომ ცენტრიფუგაციის დროს იქმნება ცენტრიფუგა ძალა, რომლის გავლენით შეჩერებული ნაწილაკები წყდება ცენტრიფუგის მილის ძირში.

1940-იანი წლების დასაწყისში ულტრაცენტრიფუგის დანერგვით, ფიჭური კომპონენტების გამოყოფა შესაძლებელი გახდა.

სანამ უჯრედებს ცენტრიფუგირებას გაუწევენ, ისინი უნდა განადგურდეს - უნდა განადგურდეს უჯრედის მემბრანების ხისტი ჩარჩო. ამისათვის გამოიყენება სხვადასხვა მეთოდი: ულტრაბგერითი ვიბრაცია, წვრილი ხვრელების დაჭერა ან მცენარეული ქსოვილების ყველაზე გავრცელებული სახეხი ფაიფურის ნაღმტყორცნებით. განადგურების მეთოდების ფრთხილად გამოყენებით, ზოგიერთი ორგანელა შეიძლება შენარჩუნდეს ხელუხლებლად.

მაღალსიჩქარიანი ცენტრიფუგაციის დროს დიდი უჯრედის კომპონენტები (როგორიცაა ბირთვები) სწრაფად წყდება (ნალექი) შედარებით დაბალი სიჩქარით და ქმნიან ნალექს ცენტრიფუგის მილის ძირში. უფრო მაღალი სიჩქარით, მცირე კომპონენტები, როგორიცაა ქლოროპლასტები და მიტოქონდრიები, გროვდება.

ანუ ცენტრიფუგაციის დროს უჯრედის კომპონენტები იშლება ფრაქციებად: დიდი და პატარა, ამიტომაა მეთოდის მეორე სახელი? დანაწილება. უფრო მეტიც, რაც უფრო მაღალია ცენტრიფუგაციის სიჩქარე და ხანგრძლივობა, მით უფრო თხელია მიღებული ფრაქცია.

კომპონენტების დალექვის (დეპონირების) სიჩქარე გამოიხატება დალექვის კოეფიციენტის გამოყენებით, რომელიც აღინიშნება S.

დიფერენციალური ცენტრიფუგაციის ეტაპები: დაბალი სიჩქარით (ბირთვები, ციტოჩონჩხი), საშუალო სიჩქარით (ქლოროპლასტები), მაღალი სიჩქარე (მიტოქონდრიები, რიზოზომები, მიკროსხეულები), ძალიან მაღალი სიჩქარე (რიბოსომები).

ფრაქციული უჯრედის ექსტრაქტები, რომლებსაც ასევე უწოდებენ უჯრედისუფალ სისტემებს, ფართოდ გამოიყენება უჯრედშიდა პროცესების შესასწავლად. მხოლოდ უჯრედულ ექსტრაქტებთან მუშაობით შეიძლება დადგინდეს ბიოლოგიური პროცესების დეტალური მოლეკულური მექანიზმი. ამრიგად, ამ კონკრეტული მეთოდის გამოყენებამ მოიტანა ტრიუმფალური წარმატება ცილების ბიოსინთეზის შესწავლაში.

ზოგადად, უჯრედშიდა სტრუქტურების სუფთა ფრაქციები შეიძლება დაექვემდებაროს ნებისმიერი ტიპის ანალიზს.

უჯრედის კულტურის მეთოდი

კულტურაში იზოლირებული ცხოველური უჯრედები (ანუ მკვებავ გარემოზე მოთავსებული) იღუპება გარკვეული რაოდენობის გაყოფის შემდეგ და, შესაბამისად, ითვლება კულტივირებისთვის რთულ და მოუხერხებელ ობიექტად. კიდევ ერთი რამ არის მცენარეული უჯრედები, რომლებსაც შეუძლიათ შეუზღუდავი რაოდენობის გაყოფა.

უჯრედის კულტურის მეთოდი ხელს უწყობს მცენარეებში უჯრედების დიფერენციაციის მექანიზმების შესწავლას.

მკვებავ გარემოზე მცენარის უჯრედები ქმნიან ერთგვაროვან არადიფერენცირებულ უჯრედულ მასას - კალუსს. კალიას მკურნალობენ ჰორმონებით. ჰორმონების გავლენის ქვეშ, კალიუსის უჯრედებმა შეიძლება წარმოქმნან სხვადასხვა ორგანოები.

დიფერენციალური ცენტრიფუგაციის მეთოდი დიფერენციალური ცენტრიფუგაციის მეთოდი
ცენტრიფუგაცია გამოიყენება
უჯრედების დანაწილება, ანუ მათი გამოყოფა
შინაარსი წილადებად, სპეციფიკიდან გამომდინარე
სხვადასხვა ორგანოელებისა და უჯრედული ჩანართების წონა.
ცენტრიფუგაციის შედეგად კომპონენტები
უჯრედები ილექება ხსნარიდან, დნება
მისი სიმკვრივის მიხედვით. უფრო მკვრივი
სტრუქტურები უფრო დაბალი ტემპებით წყდება
ცენტრიფუგაცია, ხოლო ნაკლებად მკვრივი - მაღალზე
სიჩქარეები

1. მეთოდს, რომლითაც ხდება ორგანელების უჯრედებიდან იზოლირება ე.წ
დანაწილება. ეს მეთოდი ძალიან ნაყოფიერი აღმოჩნდა
ბიოქიმიკოსებს შეუძლიათ სხვადასხვა უჯრედის ორგანელების იზოლირება
შედარებით სუფთა სახით. ის ასევე საშუალებას გაძლევთ განსაზღვროთ
ორგანელების ქიმიური შემადგენლობა და მათში შემავალი ფერმენტები და
მიღებული მონაცემების საფუძველზე გამოიტანეთ დასკვნები მათი ფუნქციების შესახებ
გალია. როგორც პირველი ნაბიჯი, უჯრედები ნადგურდება
ჰომოგენიზაცია შესაფერის გარემოში, რომელიც
უზრუნველყოფს ორგანელების უსაფრთხოებას და ხელს უშლის მათ აგრეგაციას.
2. შემდეგ ეტაპზე უჯრედის ჰომოგენატი ექვემდებარება რიგს
ცენტრიფუგაციები, რომელთა სიჩქარე და ხანგრძლივობა ყოველ ჯერზე
იზრდება; ამ პროცესს დიფერენციალური ეწოდება
ცენტრიფუგაცია. სხვადასხვა უჯრედის ორგანელები დეპონირებულია ბოლოში
ცენტრიფუგა მილები სხვადასხვა ცენტრიფუგაციის სიჩქარით,
რაც დამოკიდებულია ორგანელების ზომაზე, სიმკვრივესა და ფორმაზე.

დიფერენციალური ცენტრიფუგაციის ეტაპები:

3. მიღებული ნალექი შეიძლება შეგროვდეს და
კვლევა. ეს არის ყველაზე სწრაფად მოსაგვარებელი
დიდი და მკვრივი სტრუქტურები, როგორიცაა ბირთვები და
უფრო მცირე და ნაკლებად მკვრივი დანალექი
სტრუქტურები, როგორიცაა ბუშტები
საჭიროა ენდოპლაზმური ბადე
უფრო მაღალი სიჩქარე და გრძელი
დრო. ამიტომ დაბალი სიჩქარით
ცენტრიფუგირება, ბირთვები ნალექია და
სხვა უჯრედული ორგანელები რჩება
შეჩერებები.

დიფერენციალური ცენტრიფუგაციის ეტაპები:

4. ცენტრიფუგის დროს უპირველეს ყოვლისა და როდის
მცირე (1-3 ათასი გ) აჩქარების დროს ბირთვები დასახლდება და
დანგრეული უჯრედები 15-30 ათას გ-ზე დადგება
დიდი ნაწილაკები, მაკროსომები, შედგება
მიტოქონდრია, პატარა პლასტიდები, პეროქსიზომები, ლიზოსომები
და ა.შ., 50 ათასი გ-ზე მიკროზომები და ფრაგმენტები დასახლდება
უჯრედის ვაკუოლური სისტემა.
ნალექის შემოწმება შესაძლებელია გამოყენებით
ელექტრონული მიკროსკოპი სიწმინდის დასადგენად
მიღებული ფრაქციები. ყველა ფრაქცია გარკვეულწილად
გრადუსი დაბინძურებულია სხვა ორგანელებით. Თუ ასეა
არანაკლებ შესაძლებელია საკმარისი სისუფთავის მიღწევა
ფრაქციები, შემდეგ ისინი ექვემდებარებიან ბიოქიმიურს
ანალიზი ქიმიური შემადგენლობის დასადგენად და
იზოლირებული ორგანელების ფერმენტული აქტივობა.

სიმკვრივის გრადიენტური ცენტრიფუგაცია

ცოტა ხნის წინ კიდევ ერთი მეთოდი შეიქმნა
უჯრედის ფრაქცია – ცენტრიფუგაცია
სიმკვრივის გრადიენტში; სადაც
ცენტრიფუგაცია ტარდება საცდელ მილში, ქ
რომლებიც ადრე ერთმანეთზეა გადაფენილი
მზარდი კონცენტრაციის საქაროზის ხსნარები,
და, შესაბამისად, იზრდება სიმკვრივე. ზე
ჰომოგენატში შემავალი ცენტრიფუგაცია
ორგანელები განლაგებულია ცენტრიფუგის მილში
იმ დონეებზე, რომლებზეც განლაგებულია ხსნარები
სიმკვრივით მათ შესაბამისი საქაროზა.

ლექცია No3.

საათების რაოდენობა: 2

უჯრედის კვლევის მეთოდები

1. სინათლის მიკროსკოპია

2. ელექტრონული მიკროსკოპია, გვდადებითი და უარყოფითი მხარეები. ელექტრონული მიკროსკოპის სახეები

უჯრედები ძალიან მცირე ზომის და ამავე დროს კომპლექსური სტრუქტურისაა. ამიტომ უჯრედის აგებულებისა და ფუნქციონირების წარმატებით შესასწავლად აუცილებელია შესაბამისი ექსპერიმენტული მეთოდების ცოდნა და ათვისება.

ციტოლოგიის განვითარების პირველ ეტაპზე უჯრედების შესწავლის ერთადერთი გზა იყო სინათლის მიკროსკოპია.

მიკროსკოპიარის მოწყობილობა, რომელიც საშუალებას გაძლევთ მიიღოთ პატარა ობიექტების გაფართოებული გამოსახულება, რომლებიც შეუიარაღებელი თვალით არ ჩანს. მიკროსკოპიაში ჩვეულებრივ გამოიყენება სიგრძის შემდეგი ერთეულები:

მიკრომეტრი (1 მკმ – 10 -6 მ);

ნანომეტრი (1 ნმ – 10 -9 მ);

ანგსტრომი (1Å – 10 -10 მ).

არსებობს მსუბუქი და ელექტრონული მიკროსკოპია. სინათლის მიკროსკოპი იყენებს სინათლეს გადიდებული გამოსახულების შესაქმნელად, ხოლო ელექტრონული მიკროსკოპი იყენებს ელექტრონების ნაკადს. გამოსახულების ხარისხი განისაზღვრება მიკროსკოპის გარჩევადობით. გარჩევადობა არის უმცირესი მანძილი, რომელზეც მიკროსკოპის ოპტიკას შეუძლია ცალ-ცალკე განასხვავოს ორი მჭიდროდ დაშორებული წერტილი. რეზოლუციაადამიანის თვალი არის დაახლოებით 100 მიკრონი. ეს ნიშნავს, რომ შეუიარაღებელი თვალით, 25 სმ დაშორებით, საშუალო მხედველობის სიმახვილის მქონე დამკვირვებელს შეუძლია ერთი წერტილი მეორისგან განასხვავოს, თუ ისინი დაშორებულია მინიმუმ 100 მკმ-ით. თუ მოცემული წერტილები ერთმანეთისგან 100 μm-ზე ნაკლებია დაშორებული, ისინი ერთ ბუნდოვან წერტილად გვევლინება. საუკეთესო თანამედროვე სინათლის მიკროსკოპი შესაძლებელს ხდის შეისწავლოს სტრუქტურები ელემენტებს შორის მანძილით დაახლოებით 0,25 მიკრონი, ელექტრონული მიკროსკოპი - დაახლოებით 1,5 ა.

სინათლის მიკროსკოპია არის სხვადასხვა ოპტიკური მიკროსკოპის გამოყენებით მიკრო-ობიექტებზე დაკვირვების მეთოდების ერთობლიობა. ეს მეთოდები მნიშვნელოვნად არის დამოკიდებული მიკროსკოპის ლინზის ტიპზე, მისთვის დამხმარე მოწყობილობებზე, მიკროობიექტის ტიპზე და დაკვირვებისთვის მისი მომზადების მეთოდზე, ასევე დაკვირვების დროს მისი განათების ბუნებაზე. სინათლის მიკროსკოპის გარჩევადობა შემოიფარგლება სინათლის ტალღის სიგრძესთან შესადარებელი ზომებით (0,4–0,7 μm ხილული სინათლისთვის). თუმცა, ფიჭური სტრუქტურის მრავალი ელემენტი ზომით გაცილებით მცირეა. გარდა ამისა, ჩვეულებრივი სინათლის მიკროსკოპის გამოყენებისას, ცოცხალი უჯრედის სტრუქტურების უმეტესობა არის ოპტიკურად ცარიელი.ოპტიკურად ცარიელი სტრუქტურები არის გამჭვირვალე და თითქმის არ განსხვავდებიან რეფრაქციული ინდექსით გარემომცველი გარემოსგან. შემუშავებულია სხვადასხვა მეთოდი ასეთი სტრუქტურების იდენტიფიცირებისთვის. ფიქსაციადა შეღებვამასალა.

ფიქსაციაარის მკურნალობა, რომელიც სწრაფად წყვეტს უჯრედის სასიცოცხლო პროცესებს და შეძლებისდაგვარად ინარჩუნებს უჯრედებისა და ქსოვილების სტრუქტურას უცვლელად. ფიქსაციის შემდეგ უჯრედები საღებავებისთვის გამტარი ხდება, ლოკაცია ფიქსირდება და მაკრომოლეკულების სტრუქტურა სტაბილიზდება.

შეღებვაგამოიყენება ფიჭური სტრუქტურების ოპტიკური დიფერენციაციისთვის, აგრეთვე ციტოქიმიური კვლევებისთვის ქიმიური ნაერთების ლოკალიზაციის დასადგენად. მაგალითად, ძირითად საღებავებს (ჰემატოქსილინს) აქვთ მიდრეკილება ბირთვულ შიგთავსთან, ხოლო მჟავა საღებავები (ეოზინი) ღებავს ციტოპლაზმას. გამოიყენება ცოცხალი უჯრედების შესასწავლად სასიცოცხლო (სიცოცხლის მანძილზე) საღებავები. სასიცოცხლო საღებავები შედარებით ადვილად აღწევს ცოცხალ უჯრედებში და აფერხებს ზოგიერთ სტრუქტურას მათი დაზიანების გარეშე. თუმცა, სასიცოცხლო საღებავები არ არის სრულიად უვნებელი უჯრედისთვის და ხანგრძლივი ზემოქმედების შემდეგ იწვევს მის სიკვდილს. სასიცოცხლო საღებავები მოიცავს ნეიტრალური წითელი(ციტოპლაზმის შეღებვისთვის), მეთილენის ლურჯი(გოლჯის კომპლექსის შეღებვა) და ა.შ. სასიცოცხლო საღებავების გამოყენებით შესაძლებელი გახდა ზოგიერთი უჯრედის ორგანელების არსებობის დამტკიცება, რომლებიც ადრე შეცდომით მიიჩნიეს არტეფაქტებად.

არტეფაქტი- ცვლილება, რომელიც ხდება პრეპარატის მომზადების დროს.

ტესტირებამდე უჯრედები ან ქსოვილის ნაჭრები ჩვეულებრივ შეედინება გამდნარ პარაფინში ან სპეციალურ ფისში. ჩამოსხმისთვის გამოყენებული საშუალება გაცივებულია ან პოლიმერიზებულია. ამის შედეგად მიიღება მყარი ბლოკი, რომელიც იჭრება ძალიან თხელ ნაწილებად მიკროტომის გამოყენებით. როგორც წესი, სექციების სისქე მსუბუქი მიკროსკოპისთვის არის 1-10 μm. ამ მეთოდის მინუსი არის მრავალი უჯრედის სტრუქტურის დაზიანება. ამიტომ გამოიყენება სექციების მომზადების მეთოდი სწრაფი გაყინვის გამოყენებით. გაყინული ქსოვილი იჭრება სპეციალურ მიკროტომაზე (კრიოტომაზე), რომელიც აღჭურვილია ცივი კამერით (კრიოსტატით).

ჩვეულებრივი სინათლის მიკროსკოპის გარდა, უჯრედები შესწავლილია ბნელი ველის, ფაზა-კონტრასტის, ფლუორესცენციის და სხვა სახის სინათლის მიკროსკოპის გამოყენებით.

ბნელი ველის მიკროსკოპია. ჩვეულებრივი მიკროსკოპისგან განსხვავებით, ბნელი ველის მიკროსკოპი აღჭურვილია სპეციალური კონდენსატორით. კონდენსატორს აქვს მუქი დიაფრაგმა, რომელიც არ გადასცემს შუქს ხედვის ველის ცენტრში, ისე, რომ ობიექტი განათებულია ირიბი სხივით. ამ შემთხვევაში, მხოლოდ ობიექტის ზედაპირიდან არეკლილი და მიმოფანტული სხივები შედის მიკროსკოპის ლინზაში, რაც ზრდის ზოგიერთი სტრუქტურის კონტრასტს და ხდის მათ ხილვას. ბნელი ველის მიკროსკოპია გამოიყენება ცოცხალ უჯრედში რამდენიმე სტრუქტურის დასაკვირვებლად. კერძოდ, ბნელი ველის მიკროსკოპია გამოიყენება ფერმის ცხოველების სპერმის უჯრედებში აკროსომის დაზიანების სიხშირის დასადგენად.

ფაზის კონტრასტული მიკროსკოპია. ფაზის კონტრასტული მიკროსკოპი შეიქმნა ფრიც ზერნიკეს მიერ 1932 წელს. ფაზის კონტრასტული მიკროსკოპია შესანიშნავი მეთოდია უჯრედებზე ინტრავიტალური დაკვირვებისთვის. იგი გამოიყენება მრავალი უჯრედის ორგანელისა და ქრომოსომის შესასწავლად გაყოფის დროს. ფაზის კონტრასტული მიკროსკოპის კონდენსატორს აქვს რგოლოვანი დიაფრაგმა, რომლის მეშვეობითაც სინათლე გადის ღრუ კონუსის სახით, ხოლო დარჩენილი სხივები შეიწოვება. ლინზა შეიცავს ფაზურ ფირფიტას, რომელიც არის გამჭვირვალე დისკი ჩაღრმავებით. ჭრილის ფორმა და ზომა შეესაბამება რგოლოვანი დიაფრაგმის პირდაპირ გამოსახულებას. როდესაც ობიექტი მოთავსებულია კონდენსატორსა და ლინზას შორის ლინზის უკანა ფოკალურ სიბრტყეში, პირდაპირი გამოსახულების გარდა, ჩნდება დიაფრაგმის რამდენიმე გადახურული დიფრაქციული სურათი. ფაზის ფირფიტის ჭრილი გამოითვლება ისე, რომ სხივების ორივე სხივი, რომელიც ქმნის პირდაპირ და დიფრაქციულ სურათებს, განსხვავდება ოპტიკური ბილიკის გასწვრივ ტალღის სიგრძის მეოთხედით. ამ გზით, ფაზური განსხვავებები, რომლებიც ადრე თვალისთვის უხილავი იყო, გარდაიქმნება ინტენსივობის სხვაობებად და ხილული ხდება.

ფლუორესცენტური მიკროსკოპია არის კარგი მეთოდი უჯრედების ინტრავიტალური დაკვირვებისთვის. ფლუორესცენციული მიკროსკოპი საშუალებას გაძლევთ დააკვირდეთ მრავალი ნივთიერებისა და უჯრედის სტრუქტურის ფლუორესცენციას (ნათებას). ობიექტის ფლუორესცენცია აღფრთოვანებულია ულტრაიისფერი ან ლურჯი-იისფერი სხივებით სპეციალური სინათლის წყაროებიდან. ობიექტის გამოსხივებას ყოველთვის აქვს უფრო გრძელი ტალღის სიგრძე, ვიდრე ამაღელვებელ სინათლეს. ობიექტი განიხილება მისი ფლუორესცენციის სხივებში, რომლებიც გამოყოფილია ამაღელვებელი სინათლის სხივებისგან სინათლის ფილტრების გამოყენებით. რიგ ნივთიერებებს (ზოგიერთ ვიტამინს, პიგმენტს, ლიპიდს) აქვს საკუთარი (პირველადი) ფლუორესცენცია. უჯრედული ნივთიერებები, რომლებსაც არ გააჩნიათ ეს თვისება, წინასწარ იღებება სპეციალური საღებავებით - ფტოროქრომები, შემდეგ კი მეორადი ფლუორესცენცია შეინიშნება.

ელექტრონული მიკროსკოპია. ელექტრონული მიკროსკოპი გამოსახულების შესაქმნელად სინათლის ნაცვლად იყენებს ელექტრონების ნაკადს ვაკუუმში. ელექტრონული სხივი ფოკუსირებულია არა ლინზებით, როგორც მსუბუქი მიკროსკოპით, არამედ ელექტრომაგნიტური ველებით. გამოსახულებას აკვირდებიან ფლუორესცენტურ ეკრანზე და იღებენ ფოტოს. ელექტრონული მიკროსკოპის დროს ობიექტები ღრმა ვაკუუმშია, ამიტომ ისინი პირველად ექვემდებარება ფიქსაციას და სპეციალურ დამუშავებას. ამ მიზეზით, მხოლოდ მოკლული უჯრედების შესწავლა შესაძლებელია ელექტრონული მიკროსკოპის გამოყენებით. გარდა ამისა, ისინი უნდა იყოს ძალიან თხელი, რადგან ელექტრონების ნაკადი ძლიერად შეიწოვება ობიექტის მიერ. ამასთან დაკავშირებით, ობიექტად გამოიყენება ულტრა თხელი სექციები 20-50 ნმ სისქით, რომლებიც განთავსებულია ყველაზე თხელ ფილებზე. IN გადაცემის (გადაცემის) ელექტრონული მიკროსკოპიელექტრონები გადის ობიექტს ისევე, როგორც სინათლე გადის მასში მსუბუქი მიკროსკოპით. გადამცემი ელექტრონული მიკროსკოპია გამოიყენება მიკრობების, ქსოვილების, აგრეთვე მცირე ობიექტების სტრუქტურის (ვირუსები, დროშები და ა.შ.) ულტრა თხელი მონაკვეთების შესასწავლად. IN სკანირების ელექტრონული მიკროსკოპიელექტრონების ზუსტად ფოკუსირებული სხივი მოძრაობს წინ და უკან ნიმუშის ზედაპირზე. ამ შემთხვევაში, მისი ზედაპირიდან არეკლილი ელექტრონები გროვდება და ქმნიან გამოსახულებას. ამ ტიპის ელექტრონული მიკროსკოპის გამოყენების უპირატესობა ის არის, რომ ის ქმნის სამგანზომილებიან გამოსახულებას. ამიტომ, სკანირების ელექტრონული მიკროსკოპია გამოიყენება ობიექტების ზედაპირის შესასწავლად. ელექტრონულ მიკროსკოპს აქვს გარჩევადობა დაახლოებით 1-2 ნმ. ეს საკმარისია მაკრომოლეკულების შესასწავლად.

ავტორენტგენოგრაფია. ეს მეთოდი ემყარება რადიოაქტიური იზოტოპებით მონიშნული ნივთიერებების გამოყენებას. თუ რადიოაქტიური იზოტოპი ემატება გარემოს და შეიწოვება უჯრედების მიერ მეტაბოლიზმის დროს, მისი უჯრედშიდა ლოკალიზაცია შემდგომში შეიძლება გამოვლინდეს ავტორადიოგრაფიის გამოყენებით. ამ მეთოდით, უჯრედების თხელი მონაკვეთები იდება ფილმზე. ფილმი ბნელდება იმ ადგილების ქვეშ, სადაც რადიოაქტიური იზოტოპებია განთავსებული. ფოსფორი გამოიყენება იზოტოპად ( P 32), რკინა (Fe 59), გოგირდი (S 35 ), ნახშირბადი (C 14), ტრიტიუმი ( H 3) და ა.შ.

ცენტრიფუგაცია. მეთოდი 1926 წელს დაიწყო, როდესაც სვედბერგმა გამოიგონა ანალიტიკური ცენტრიფუგა და გამოიყენა ჰემოგლობინის მოლეკულური წონის დასადგენად. ცენტრიფუგამდე აუცილებელია უჯრედის მემბრანის განადგურება. განადგურება ხორციელდება ულტრაბგერითი ვიბრაციის, ოსმოსური შოკის, დაფქვისა და მცირე ხვრელის მეშვეობით დაჭერით. ფრთხილად განადგურებით, ზოგიერთი უჯრედის ორგანელა ხელუხლებელი რჩება. დაჭრილ ქსოვილებს განადგურებული უჯრედის მემბრანებით ათავსებენ სინჯარებში და ატრიალებენ ცენტრიფუგაში დიდი სიჩქარით. მეთოდი ეფუძნება იმ ფაქტს, რომ სხვადასხვა უჯრედულ ორგანელებს აქვთ განსხვავებული მასა და სიმკვრივე. უფრო მკვრივი ორგანელები დეპონირდება საცდელ მილში ცენტრიფუგაციის დაბალი სიჩქარით, ნაკლებად მკვრივი - მაღალი სიჩქარით. ეს ფენები ცალკე შესწავლილია. ამრიგად, ბირთვები და დანგრეული უჯრედები სწრაფად წყდება შედარებით დაბალი სიჩქარით და ქმნიან ნალექს ცენტრიფუგის მილის ძირში. უფრო მაღალი სიჩქარით, მიტოქონდრია ნალექი ხდება, ხოლო კიდევ უფრო მაღალი სიჩქარითა და ცენტრიფუგაციის ხანგრძლივ პერიოდებში, რიბოსომები ნალექი ხდება. როგორც წესი, ასეთი გაწმენდილი კომპონენტები ინარჩუნებენ მაღალ ბიოქიმიურ აქტივობას.

უჯრედისა და ქსოვილის კულტურის მეთოდი მდგომარეობს იმაში, რომ სპეციალურ საკვებ გარემოზე ერთი ან რამდენიმე უჯრედიდან შეიძლება მიღებულ იქნას იმავე ტიპის უჯრედების ჯგუფი. ამ მეთოდს უზარმაზარი პერსპექტივები აქვს არა მხოლოდ ციტოლოგიაში, არამედ მედიცინასა და სოფლის მეურნეობაში. ამრიგად, უჯრედული კულტურები გამოიყენება დიფერენციაციის ნიმუშების გასარკვევად, უჯრედების გარემოსთან ურთიერთქმედების, ადაპტაციის, დაბერების, ტრანსფორმაციის და ა.შ. ბიოტექნოლოგიაში უჯრედული კულტურები გამოიყენება ვაქცინების და ბიოლოგიურად აქტიური ნივთიერებების წარმოებაში. ფარმაკოლოგიაში ისინი გამოიყენება როგორც ტესტის ობიექტები ახალი წამლების ტესტირებისას. ამ მეთოდის ფუძემდებელია ამერიკელი ზოოლოგი და ემბრიოლოგი R. Garrison (1879-1959), რომელმაც 1907 წელს მოახერხა სხეულის გარეთ ხელოვნურ გარემოში სალამანდრის უჯრედების გაშენება. შემდგომში გაიზარდა მრავალი სახის მცენარეული და ცხოველური უჯრედიინ ვიტრო და ამ მეთოდმა მოგვცა საშუალება გაგვეკეთებინა არაერთი მნიშვნელოვანი აღმოჩენა უჯრედის ფიზიოლოგიის სფეროში. გამოხატულებაინ ვიტრო (ლათინურად „მინაში“) ნიშნავს, რომ კვლევა ჩატარდა არა ცოცხალ ორგანიზმზე, არამედ ამა თუ იმ სახის მინის ჭურჭელში. პირველი გამოთქმისგან განსხვავებით in vivo მიუთითებს ექსპერიმენტზე მთლიან, ცოცხალ ორგანიზმზე. უშუალოდ სხეულის ქსოვილებიდან მომზადებულ კულტურებს ე.წ პირველადი კულტურები.უმეტეს შემთხვევაში, პირველადი კულტურის უჯრედები შეიძლება გადავიდეს კულტურის ჭურჭლიდან და გამოყენებული იქნას დიდი რაოდენობით წარმოებისთვის მეორადი კულტურები.უჯრედული ხაზები შეიძლება გამოყენებულ იქნას კლონების შესაქმნელად, რომლებიც წარმოიქმნება ერთი წინამორბედი უჯრედიდან. Შეიძლება გაკეთდეს უჯრედების შერწყმაერთი ან სხვადასხვა ტიპის. შერწყმის მისაღწევად, უჯრედები ექვემდებარება ვირუსულ ფერმენტებს ან პოლიეთილენ გლიკოლს. ეს ნივთიერებები აზიანებს უჯრედების პლაზმურ მემბრანას, რის შედეგადაც წარმოიქმნება უჯრედი ორი ცალკეული ბირთვით. გარკვეული დროის გასვლის შემდეგ, ასეთი უჯრედი იყოფა მიტოზით და წარმოქმნის ჰიბრიდულ უჯრედს. ჰიბრიდულ უჯრედში ყველა ქრომოსომა გაერთიანებულია ერთ დიდ ბირთვში. ასეთი ჰიბრიდული უჯრედების კლონირება შესაძლებელია ჰიბრიდული უჯრედული ხაზის წარმოებისთვის. ამ მეთოდის გამოყენებით შესაძლებელი გახდა ადამიანისა და თაგვის, ადამიანისა და გომბეშოს ჰიბრიდული უჯრედების მიღება. შედეგად მიღებული ჰიბრიდული უჯრედები არასტაბილურია და მრავალი უჯრედის დაყოფის შემდეგ კარგავენ ერთი ან მეორე ტიპის ქრომოსომების უმეტესობას. საბოლოო პროდუქტი ხდება, მაგალითად, არსებითად თაგვის უჯრედი, რომელსაც არ აქვს ან მხოლოდ კვალი აქვს ადამიანის გენი. აქედან გამომდინარე, ამ ტექნიკის წარმატებით გამოყენება შესაძლებელია ადამიანის ქრომოსომებში გენების გამოსასწორებლად.

მიკროქირურგია.ეს მეთოდი ეფუძნება მიკრომანიპულატორების გამოყენებას. ეს არის მოწყობილობები, რომლებიც უზრუნველყოფენ მიკროინსტრუმენტების ზუსტ მოძრაობას გალიაში. მიკრო ინსტრუმენტები, როგორც წესი, დამზადებულია მინისგან. მათი ფორმა განისაზღვრება მიკროქირურგიული ოპერაციების ამოცანებით. ისინი შეიძლება იყოს ნემსების, შპრიცების, პიპეტების, სპატულების, სკალპელების და ა.შ. მიკრომანიპულატორების გამოყენებით შეიძლება ჩატარდეს სხვადასხვა ოპერაციები უჯრედებზე (უჯრედებში ნივთიერებების შეყვანა, ბირთვების ამოღება და გადანერგვა, უჯრედული სტრუქტურების ადგილობრივი დაზიანება და ა.შ.). მიკროქირურგიული ოპერაციები განსაკუთრებით კარგად მუშაობს დიდ უჯრედებზე (უჯრედოვანი უჯრედები, ამფიბიების კვერცხები, ზოგიერთი ცხოველის ემბრიონის უჯრედები). ასე რომ, ამება უჯრედი შეიძლება დაიყოს სამ ძირითად კომპონენტად - მემბრანა, ციტოპლაზმა და ბირთვი. შემდეგ ეს კომპონენტები შეიძლება ხელახლა შეიკრიბონ ცოცხალი უჯრედის შესაქმნელად. ამ გზით შეიძლება მიღებულ იქნას ხელოვნური უჯრედები, რომლებიც შედგება სხვადასხვა ტიპის ამებაების კომპონენტებისგან. მიკროქირურგიული ოპერაციები ტარდება არა მხოლოდ მიკროინსტრუმენტებით, არამედ ულტრაიისფერი სხივების ფოკუსირებული სხივით (სხივის მიკროინექციით).

ზემოაღნიშნული მეთოდების გარდა, უჯრედების შესასწავლად გამოიყენება ქრომატოგრაფია, ელექტროფორეზი და სხვა. ახალმა მეთოდებმა უზარმაზარი პროგრესი მიაღწია უჯრედების შესწავლას. თუმცა, უნდა გვახსოვდეს, რომ ციტოლოგიის კლასიკური მეთოდები, რომლებიც დაფუძნებულია უჯრედების ფიქსაციაზე, შეღებვაზე და სინათლის მიკროსკოპის ქვეშ შესწავლაზე, ჯერ კიდევ ინარჩუნებს პრაქტიკულ მნიშვნელობას.

ლექცია 1.

მცენარეული უჯრედის სტრუქტურა

სინათლის მიკროსკოპია

ელექტრონული მიკროსკოპია

დიფერენციალური ცენტრიფუგაცია

უჯრედის კულტურის მეთოდი

უჯრედი ცოცხალი ორგანიზმების ძირითადი სტრუქტურული და ფუნქციური ერთეულია.

უჯრედები ემბრიონულიცხოველებისა და მცენარეების (არასპეციალიზებული) ქსოვილები სტრუქტურული თვალსაზრისით ძალიან ჰგავს. სწორედ ეს გარემოება იყო ერთ დროს უჯრედის თეორიის გაჩენისა და განვითარების მიზეზი. მორფოლოგიური განსხვავებები უკვე ჩნდება მცენარეებისა და ცხოველების სპეციალიზებული ქსოვილების დიფერენცირებულ უჯრედებში. მცენარეული უჯრედის სტრუქტურული თავისებურებები, ისევე როგორც მთლიანად მცენარეები, დაკავშირებულია ცხოვრების წესთან და კვებასთან. მცენარეთა უმეტესობა შედარებით უმოძრაო (მიმაგრებული) ცხოვრების წესს უტარებს. მცენარის კვების სპეციფიკა არის ის, რომ წყალი და საკვები ნივთიერებები: ორგანული და არაორგანული, მიმოფანტულია ირგვლივ და მცენარემ უნდა შეიწოვოს ისინი დიფუზიის გზით. გარდა ამისა, შუქზე მწვანე მცენარეები ახორციელებენ კვების აუტოტროფიულ მეთოდს. ამის წყალობით, მცენარეთა უჯრედების სტრუქტურისა და ზრდის ზოგიერთი სპეციფიკური მახასიათებელი განვითარდა. Ესენი მოიცავს:

	გამძლე პოლისაქარიდის უჯრედის კედელი, უჯრედის გარშემო და ხისტი ჩარჩოს შედგენა;
	პლასტიდური სისტემა , რომელიც წარმოიშვა კვების აუტოტროფულ ტიპთან დაკავშირებით;
	ვაკუოლური სისტემა , რომელიც მომწიფებულ უჯრედებში ჩვეულებრივ წარმოდგენილია დიდი ცენტრალური ვაკუოლით, რომელიც იკავებს უჯრედის მოცულობის 95%-მდე და მნიშვნელოვან როლს ასრულებს შენარჩუნებაში. ტურგორული წნევა;
	სპეციალური ტიპის უჯრედების ზრდის მიერ დაჭიმულობა(ვაკუოლის მოცულობის გაზრდის გამო);
	ტოტიპოტენცია , ანუ დიფერენცირებული მცენარეული უჯრედიდან სრული მცენარის რეგენერაციის შესაძლებლობა;
	არის კიდევ ერთი დეტალი, რომელიც განასხვავებს მცენარეთა უჯრედებს ცხოველური უჯრედებისგან: მცენარეებში, უჯრედების გაყოფის დროს, ისინი არ არის გამოხატული. ცენტრიოლები.

უჯრედის სტრუქტურა მისი ყველაზე ზოგადი ფორმით თქვენთვის ცნობილია თქვენი ზოგადი ბიოლოგიის კურსიდან და მისაღები გამოცდებისთვის მომზადებისას საკმაოდ კარგად შეისწავლეთ ეს თემა. ეს თემა ასევე განიხილება სხვადასხვა ასპექტში შესაბამის საუნივერსიტეტო კურსებში (მაგალითად, უხერხემლო ზოოლოგია, ქვედა მცენარეები). გარდა ამისა, უჯრედის უფრო დეტალური გაცნობა მაღალ დონეზე იქნება "ციტოლოგიის" კურსში. ჩვენთვის მნიშვნელოვანია ფოკუსირება მცენარეული უჯრედის სპეციფიკურ სტრუქტურულ მახასიათებლებზე, ძირითადად უმაღლესი მცენარის უჯრედებზე.

ტიპიური მცენარეული უჯრედის სტრუქტურის ძალიან ზედაპირული გამოკვლევა ავლენს სამ ძირითად კომპონენტს: (1) უჯრედის კედელი, (2) ვაკუოლი, რომელიც იკავებს ცენტრალურ ადგილს მომწიფებულ უჯრედებში და ავსებს მათ თითქმის მთელ მოცულობას და (3) პროტოპლასტი, ვაკუოლით უბიძგებს პერიფერიაზე კედლის შრის სახით. სწორედ ეს კომპონენტები ვლინდება სინათლის მიკროსკოპის დაბალი გადიდების დროს. უფრო მეტიც, უჯრედის მემბრანა და ვაკუოლი პროტოპლასტის სასიცოცხლო აქტივობის პროდუქტებია.

ცოცხალი უჯრედის სხეული? პროტოპლასტი შედგება ორგანელებისგან ჩაძირული ჰიალოპლაზმა. უჯრედული ორგანიზმებია: ბირთვი, პლასტიდები, მიტოქონდრია, დიქტოზომები, ენდოპლაზმური ბადე, მიკროსხეულები და ა.შ. ციტოპლაზმაუჯრედები.

უჯრედქვეშა სტრუქტურების ზომის გამოსახატავად გამოიყენება სიგრძის გარკვეული ზომები: მიკრომეტრიდა ნანომეტრი.

მიკრომეტრი საზომი ერთეულების SI სისტემაში არის 10 -6 მ-ის ტოლი მნიშვნელობა . სხვა სიტყვებით რომ ვთქვათ, მიკრომეტრი (აბრევიატურა μm) არის 1/1000000 მეტრი და 1/1000 მილიმეტრი. 1 მკმ = 10-6 მ . ამ ღონისძიების ძველი სახელი მიკრონი.

ნანომეტრი იმავე სისტემაში წარმოადგენს მილიმეტრის მემილიონედს 1 ნმ = 10 -9 მ და მეათასედი მიკრომეტრი.

მცენარეთა უჯრედების ზომა და ფორმა ძალიან განსხვავდება. როგორც წესი, უმაღლესი მცენარეების უჯრედის ზომა მერყეობს 10-დან 300 მიკრონიმდე. მართალია, არის გიგანტური უჯრედები, მაგალითად, ციტრუსის ხილის წვნიანი რბილობის უჯრედები დიამეტრის რამდენიმე მილიმეტრია, ან ჭინჭრის უკიდურესად გრძელი ბასტის ბოჭკოები აღწევს 80 მმ სიგრძეს მიკროსკოპული სისქით.

ისინი გამოირჩევიან ფორმის მიხედვით იზოდიამეტრულიუჯრედები, რომელთა ხაზოვანი ზომები ყველა მიმართულებით თანაბარია ან ოდნავ განსხვავდება (ანუ ამ უჯრედების სიგრძე, სიგანე და სიმაღლე შედარებულია). ასეთ უჯრედებს პარენქიმული ეწოდება (პარენქიმა).

ძლიერ წაგრძელებულ უჯრედებს, რომლებშიც სიგრძე ბევრჯერ (ზოგჯერ ასეულობით და ათასობით) აღემატება სიმაღლესა და სიგანეს, ეწოდება პროზენქიმული. (პროზენქიმა).

მცენარეთა უჯრედების შესწავლის მეთოდები

უჯრედების შესასწავლად შემუშავებულია და გამოიყენება მრავალი მეთოდი, რომელთა შესაძლებლობები განსაზღვრავს ჩვენი ცოდნის დონეს ამ სფეროში. უჯრედული ბიოლოგიის შესწავლის მიღწევები, მათ შორის ბოლო წლების ყველაზე გამორჩეული მიღწევები, ჩვეულებრივ დაკავშირებულია ახალი მეთოდების გამოყენებასთან. ამიტომ, უჯრედული ბიოლოგიის უფრო სრულყოფილი გაგებისთვის, აუცილებელია უჯრედების შესწავლის შესაბამისი მეთოდების გააზრება მაინც.

სინათლის მიკროსკოპია

უჯრედების შესწავლის უძველესი და, ამავდროულად, ყველაზე გავრცელებული მეთოდი მიკროსკოპია. შეგვიძლია ვთქვათ, რომ უჯრედების შესწავლის დასაწყისი სინათლის ოპტიკური მიკროსკოპის გამოგონებამ ჩაუყარა.

ადამიანის შეუიარაღებელი თვალის გარჩევადობა დაახლოებით 1/10 მმ-ია. ეს ნიშნავს, რომ თუ დააკვირდებით ორ ხაზს, რომლებიც ერთმანეთისგან 0,1 მმ-ზე ნაკლებია, ისინი გაერთიანდებიან ერთში. უფრო მჭიდროდ განლაგებული სტრუქტურების გამოსაყოფად გამოიყენება ოპტიკური ინსტრუმენტები, როგორიცაა მიკროსკოპი.

მაგრამ სინათლის მიკროსკოპის შესაძლებლობები უსაზღვრო არ არის. სინათლის მიკროსკოპის გარჩევადობის ზღვარი დგინდება სინათლის ტალღის სიგრძით, ანუ ოპტიკური მიკროსკოპი შეიძლება გამოყენებულ იქნას მხოლოდ სტრუქტურების შესასწავლად, რომელთა მინიმალური ზომები შედარებულია სინათლის გამოსხივების ტალღის სიგრძესთან. საუკეთესო სინათლის მიკროსკოპს აქვს დაახლოებით 0,2 მიკრონი (ანუ 200 ნმ), რაც დაახლოებით 500-ჯერ უკეთესია, ვიდრე ადამიანის თვალი. მაღალი გარჩევადობის მსუბუქი მიკროსკოპის აგება თეორიულად შეუძლებელია.

უჯრედის მრავალი კომპონენტი მსგავსია მათი ოპტიკური სიმკვრივით და, სპეციალური დამუშავების გარეშე, პრაქტიკულად უხილავია ჩვეულებრივი სინათლის მიკროსკოპით. იმისათვის, რომ ისინი ხილული იყოს, მრავალფეროვანი საღებავებიგარკვეული სელექციურობით.

მე-19 საუკუნის დასაწყისში. საჭირო იყო საღებავები ტექსტილის ქსოვილების შესაღებად, რაც თავის მხრივ ორგანული ქიმიის დაჩქარებულ განვითარებას იწვევდა. აღმოჩნდა, რომ ამ საღებავებიდან ზოგიერთი ასევე აფერხებს ბიოლოგიურ ქსოვილებს და, სრულიად მოულოდნელად, ხშირად უპირატესად აკავშირებს უჯრედის გარკვეულ კომპონენტებს. ასეთი შერჩევითი საღებავების გამოყენება შესაძლებელს ხდის უჯრედის შიდა სტრუქტურის უფრო ზუსტად შესწავლას. აქ არის მხოლოდ რამდენიმე მაგალითი:

	საღებავი ჰემატოქსილინიაფერადებს ბირთვის ზოგიერთ კომპონენტს ლურჯი ან იისფერი;
	თანმიმდევრული დამუშავების შემდეგ ფლოროგლუცინოლიშემდეგ კი მარილმჟავასთან ერთად ლიგნიფიცირებული უჯრედის მემბრანა ხდება ალუბლისფერი წითელი;
	საღებავი სუდანი IIIაფერადებს უჯრედულ მემბრანებს ვარდისფრად;
	კალიუმის იოდიდში იოდის სუსტი ხსნარი სახამებლის მარცვლებს ლურჯ აქცევს.

შეღებვამდე ქსოვილების უმეტესობის მიკროსკოპული გამოკვლევისთვის გაასწორონ. მას შემდეგ რაც ფიქსირდება, უჯრედები საღებავებისთვის გამტარი ხდება და უჯრედის სტრუქტურა სტაბილიზდება. ბოტანიკაში ერთ-ერთი ყველაზე გავრცელებული ფიქსატორი არის ეთილის სპირტი.

ფიქსაცია და შეღებვა არ არის ერთადერთი პროცედურა, რომელიც გამოიყენება პრეპარატების მოსამზადებლად. ქსოვილების უმეტესობა ზედმეტად სქელია იმისთვის, რომ დაუყონებლივ დაფიქსირდეს მაღალი გარჩევადობით. ამიტომ, თხელი სექციები შესრულებულია მიკროტომი. ეს მოწყობილობა იყენებს პურის საჭრელ პრინციპს. მცენარეთა ქსოვილებს სჭირდებათ ოდნავ სქელი მონაკვეთები, ვიდრე ცხოველური ქსოვილები, რადგან მცენარეული უჯრედები, როგორც წესი, უფრო დიდია. მცენარის ქსოვილის მონაკვეთების სისქე მსუბუქი მიკროსკოპისთვის არის დაახლოებით 10 მიკრონი - 20 მიკრონი. ზოგიერთი ქსოვილი ზედმეტად რბილია, რომ დაუყოვნებლივ მოიჭრას. ამიტომ ფიქსაციის შემდეგ მათ ასხამენ გამდნარ პარაფინში ან სპეციალურ ფისში, რომელიც აჯერებს მთელ ქსოვილს. გაგრილების შემდეგ წარმოიქმნება მყარი ბლოკი, რომელიც შემდეგ იჭრება მიკროტომის გამოყენებით. მართალია, შევსება ბევრად უფრო იშვიათად გამოიყენება მცენარეული ქსოვილებისთვის, ვიდრე ცხოველებისთვის. ეს აიხსნება იმით, რომ მცენარეთა უჯრედებს აქვთ ძლიერი უჯრედის კედლები, რომლებიც ქმნიან ქსოვილის ჩარჩოს. განსაკუთრებით გამძლეა ლიგნიფიცირებული ჭურვები.

თუმცა, ჩამოსხმამ შეიძლება დაარღვიოს უჯრედის სტრუქტურა, ამიტომ გამოიყენება სხვა მეთოდი, სადაც ეს საფრთხე მცირდება? სწრაფი გაყინვა. აქ შეგიძლიათ გააკეთოთ ფიქსაციისა და შევსების გარეშე. გაყინული ქსოვილი იჭრება სპეციალური მიკროტომის გამოყენებით (კრიოტომა).

ამ გზით მომზადებულ გაყინულ მონაკვეთებს აქვთ ბუნებრივი სტრუქტურული მახასიათებლების უკეთ შენარჩუნების განსაკუთრებული უპირატესობა. თუმცა, მათი მომზადება უფრო რთულია და ყინულის კრისტალების არსებობა მაინც ანგრევს ზოგიერთ დეტალს.

მიკროსკოპები ყოველთვის აწუხებდნენ ფიქსაციისა და შეღებვის პროცესში ზოგიერთი უჯრედის კომპონენტის დაკარგვისა და დამახინჯების შესაძლებლობით. აქედან გამომდინარე, მიღებული შედეგები მოწმდება სხვა მეთოდებით.

ცოცხალი უჯრედების მიკროსკოპის ქვეშ გამოკვლევის შესაძლებლობა, მაგრამ ისე, რომ მათი სტრუქტურის დეტალები უფრო მკაფიოდ გამოჩნდეს, ძალიან მაცდური ჩანდა. ეს შესაძლებლობა მოცემულია სპეციალური ოპტიკური სისტემებით: ფაზის კონტრასტიდა ჩარევამიკროსკოპები. ცნობილია, რომ სინათლის ტალღებს, ისევე როგორც წყლის ტალღებს, შეუძლიათ ხელი შეუშალონ ერთმანეთს, გაზარდონ ან შეამცირონ წარმოქმნილი ტალღების ამპლიტუდა. ჩვეულებრივ მიკროსკოპში, როდესაც სინათლის ტალღები გადის უჯრედის ცალკეულ კომპონენტებში, ისინი ცვლის მათ ფაზას, თუმცა ადამიანის თვალი ვერ ამჩნევს ამ განსხვავებებს. მაგრამ ჩარევის გამო, ტალღები შეიძლება გარდაიქმნას, შემდეგ კი უჯრედის სხვადასხვა კომპონენტი შეიძლება განვასხვავოთ ერთმანეთისგან მიკროსკოპის ქვეშ, შეღებვის გარეშე. ეს მიკროსკოპები იყენებენ სინათლის ტალღების 2 სხივს, რომლებიც ურთიერთქმედებენ (ზედმეტად) ერთმანეთზე, ზრდიან ან ამცირებენ ტალღების ამპლიტუდას, რომლებიც შედიან უჯრედის სხვადასხვა კომპონენტიდან თვალში.

ელექტრონული მიკროსკოპია

სინათლის მიკროსკოპის შესაძლებლობები, როგორც უკვე აღვნიშნეთ, შემოიფარგლება ხილული სინათლის ტალღის სიგრძით. მისი მაქსიმალური გარჩევადობა არის დაახლოებით 0.2 მიკრონი.

1920-იან წლებში მიკროსკოპიაში მნიშვნელოვანი წინსვლა განხორციელდა, როდესაც აღმოაჩინეს, რომ სათანადოდ შერჩეული ელექტრომაგნიტური ველები შეიძლება გამოყენებულ იქნას როგორც ლინზები ელექტრონული სხივების ფოკუსირებისთვის.

ელექტრონის ტალღის სიგრძე გაცილებით მოკლეა ვიდრე ხილული სინათლის ტალღის სიგრძე და თუ სინათლის ნაცვლად ელექტრონები გამოიყენება, მიკროსკოპის გარჩევადობის ზღვარი შეიძლება შესამჩნევად შემცირდეს.

ყოველივე ამის საფუძველზე შეიქმნა მიკროსკოპი, რომელშიც სინათლის ნაცვლად გამოყენებულია ელექტრონების სხივი. პირველი ელექტრონული მიკროსკოპი 1931 წელს ააგეს კნოლმა და რუსკამ გერმანიაში. თუმცა, მრავალი წელი გავიდა, სანამ ამ მიკროსკოპის გამოყენებით ქსოვილის სექციების შესწავლა შესაძლებელი გახდა. მხოლოდ 50-იან წლებში შემუშავდა საჭირო თვისებების მქონე სექციების წარმოების მეთოდები. ამ დროიდან დაიწყო მიკროსკოპის ახალი ერა და უჯრედების მშვენიერი სტრუქტურის შესახებ ინფორმაციის ნაკადი ფაქტიურად მეცნიერებაში გადაიზარდა. (უჯრედის ულტრასტრუქტურა).

ელექტრონული მიკროსკოპის სირთულე იმაში მდგომარეობს, რომ ბიოლოგიური ნიმუშების შესასწავლად აუცილებელია პრეპარატების სპეციალური დამუშავება.

პირველი სირთულე ის არის, რომ ელექტრონებს აქვთ ძალიან შეზღუდული შეღწევის ძალა, ამიტომ უნდა მომზადდეს ულტრა თხელი სექციები, 50-100 ნმ სისქით. ასეთი თხელი სექციების მისაღებად ქსოვილი ჯერ ფისოვანია გაჟღენთილი: ფისი პოლიმერიზდება მყარი პლასტმასის ბლოკად. შემდეგ ბასრი შუშის ან ბრილიანტის დანის გამოყენებით სექციები იჭრება სპეციალურ მიკროტომაზე.

არის კიდევ ერთი სირთულე: როდესაც ელექტრონები ბიოლოგიურ ქსოვილში გადიან, კონტრასტული გამოსახულება არ მიიღება. კონტრასტის მისაღებად ბიოლოგიური ნიმუშების თხელი მონაკვეთები გაჟღენთილია მძიმე მეტალების მარილებით.

არსებობს ელექტრონული მიკროსკოპის ორი ძირითადი ტიპი. IN გადაცემა(გადამცემი) მიკროსკოპი, ელექტრონების სხივი, რომელიც გადის სპეციალურად მომზადებულ ნიმუშზე, თავის გამოსახულებას ტოვებს ეკრანზე. თანამედროვე გადამცემი ელექტრონული მიკროსკოპის გარჩევადობა თითქმის 400-ჯერ აღემატება სინათლის გარჩევადობას. ამ მიკროსკოპებს აქვთ გარჩევადობა დაახლოებით 0,5 ნმ (შედარებისთვის, წყალბადის ატომის დიამეტრი დაახლოებით 0,1 ნმ).

მიუხედავად ასეთი მაღალი გარჩევადობისა, გადამცემ ელექტრონულ მიკროსკოპებს აქვთ მნიშვნელოვანი უარყოფითი მხარეები:

სამგანზომილებიანი (მოცულობითი) გამოსახულება მიიღება გამოყენებით სკანირებაელექტრონული მიკროსკოპი (EM). აქ სხივი არ გადის ნიმუშში, მაგრამ აისახება მისი ზედაპირიდან.

საცდელი ნიმუში ფიქსირდება და გამხმარია და შემდეგ დაფარულია ლითონის თხელი ფენით? ოპერაცია ეწოდება დაჩრდილვა(ნიმუში დაჩრდილულია).

EM სკანირებისას ფოკუსირებული ელექტრონული სხივი მიმართულია ნიმუშზე (ნიმუში დასკანირებულია). შედეგად, ნიმუშის ლითონის ზედაპირი ასხივებს დაბალი ენერგიის მეორად ელექტრონებს. ისინი ჩაიწერება და გარდაიქმნება სურათად ტელევიზორის ეკრანზე. სკანირების მიკროსკოპის მაქსიმალური გარჩევადობა მცირეა, დაახლოებით 10 ნმ, მაგრამ გამოსახულება სამგანზომილებიანია.

გაყინვა-ჩიპის მეთოდი

ელექტრონული მიკროსკოპის ფუნდამენტურად ახალი შესაძლებლობები გაიხსნა შედარებით ცოტა ხნის წინ, მეთოდის შემუშავების შემდეგ. "გაყინვა - ჩიპება".ამ მეთოდის გამოყენებით, უჯრედის სტრუქტურის საუკეთესო დეტალები შეისწავლება და სამგანზომილებიანი გამოსახულება მიიღება გადამცემ ელექტრონულ მიკროსკოპში.

ნორმალური გაყინვის დროს უჯრედებში წარმოიქმნება ყინულის კრისტალები, რომლებიც შესამჩნევად ამახინჯებენ მათ სტრუქტურას. ამის თავიდან ასაცილებლად უჯრედები ძალიან სწრაფად იყინება თხევადი აზოტის ტემპერატურაზე (- 196 C). ასეთი მყისიერი გაყინვით, ყინულის კრისტალებს არ აქვთ დრო, რომ ჩამოყალიბდნენ და უჯრედი არ განიცდის დეფორმაციას.

გაყინული ბლოკი იყოფა დანის პირით (აქედან მომდინარეობს მეთოდის სახელი). შემდეგ, ჩვეულებრივ, ვაკუუმურ კამერაში, ჭარბი ყინული ამოღებულია სუბლიმაციით. ამ ოპერაციას ე.წ გრავირება.აკრავის შემდეგ უფრო მკაფიოდ არის განსაზღვრული რელიეფი გაყოფის სიბრტყეში. მიღებული ნიმუში დაჩრდილული,ანუ ნიმუშის ზედაპირზე იფრქვევა მძიმე მეტალების თხელი ფენა. თუმცა, ხრიკი ის არის, რომ დეპონირება ხორციელდება ნიმუშის ზედაპირის კუთხით. ეს ძალიან მნიშვნელოვანი პუნქტია. ჩნდება ჩრდილის ეფექტი და გამოსახულება გამოიყურება სამგანზომილებიანი.

გადამცემ მიკროსკოპში ელექტრონის სხივს შეუძლია შეაღწიოს მხოლოდ ძალიან თხელ მონაკვეთებში. დაჩრდილული ნიმუშების ჩვეულებრივი სისქე გადაჭარბებულია, ამიტომ ლითონის ფენის საფუძვლიანი ორგანული ნივთიერებები უნდა დაიშალა. შედეგი არის თხელი ლითონი რეპლიკა(ან ანაბეჭდი) ნიმუშის ზედაპირიდან. რეპლიკა გამოიყენება გადამცემ მიკროსკოპში.

დიფერენციალური ცენტრიფუგაცია

გარდა მიკროსკოპისა, უჯრედების შესწავლის სხვა ძირითადი და ფართოდ გავრცელებული მეთოდია დიფერენციალური ცენტრიფუგაციაან დანაწილება.

კომპონენტების დალექვის (დეპონირების) სიჩქარე გამოიხატება გამოყენებით დალექვის კოეფიციენტი,დანიშნული ს.

უჯრედის კულტურის მეთოდი

ქმნიან თუ არა მცენარის უჯრედები მკვებავ გარემოზე ერთგვაროვან არადიფერენცირებულ უჯრედულ მასას? კალიუსი.კალიას მკურნალობენ ჰორმონებით. ჰორმონების გავლენის ქვეშ, კალიუსის უჯრედებმა შეიძლება წარმოქმნან სხვადასხვა ორგანოები.

მცენარეული უჯრედის სტრუქტურა და ფუნქციონირება.

1. მცენარის უჯრედის აგებულება: ცელულოზის მემბრანა, პლაზმური მემბრანა, ციტოპლაზმა ორგანელებით, ბირთვი, ვაკუოლები უჯრედის წვენით. პლასტიდების არსებობა მცენარის უჯრედის მთავარი მახასიათებელია.

2. უჯრედის მემბრანის ფუნქციები - აძლევს უჯრედს ფორმას, იცავს მას გარემო ფაქტორებისგან.

3. პლაზმური მემბრანა არის თხელი გარსი, შედგება ლიპიდების და ცილების ურთიერთმოქმედი მოლეკულებისგან, ზღუდავს შიდა შიგთავსს გარე გარემოდან, უზრუნველყოფს წყლის, მინერალებისა და ორგანული ნივთიერებების გადატანას უჯრედში ოსმოსითა და აქტიური ტრანსპორტით და ასევე შლის მავნე ნარჩენების პროდუქტები.

4. ციტოპლაზმა არის უჯრედის შიდა ნახევრად თხევადი გარემო, რომელშიც განლაგებულია ბირთვი და ორგანელები, უზრუნველყოფს მათ შორის კავშირებს და მონაწილეობს ძირითად სასიცოცხლო პროცესებში.

5. ენდოპლაზმური ბადე - განშტოებული არხების ქსელი ციტოპლაზმაში. მონაწილეობს ცილების, ლიპიდების და ნახშირწყლების სინთეზში და ნივთიერებების ტრანსპორტირებაში. რიბოსომები არის სხეულები, რომლებიც მდებარეობს ER-ზე ან ციტოპლაზმაში, შედგება რნმ-ისა და ცილისგან და მონაწილეობენ ცილის სინთეზში. EPS და რიბოსომები არის ერთი აპარატი ცილების სინთეზისა და ტრანსპორტირებისთვის.

6. მიტოქონდრია ციტოპლაზმიდან ორი მემბრანით შემოფარგლული ორგანელებია. მათში ფერმენტების მონაწილეობით ხდება ორგანული ნივთიერებების დაჟანგვა და ატფ-ის მოლეკულების სინთეზირება. შიდა მემბრანის ზედაპირის ზრდა, რომელზედაც განლაგებულია ფერმენტები კრისტალების გამო. ATP არის ენერგიით მდიდარი ორგანული ნივთიერება.

7. პლასტიდები (ქლოროპლასტები, ლეიკოპლასტები, ქრომოპლასტები), მათი შემცველობა უჯრედში მცენარის ორგანიზმის მთავარი მახასიათებელია. ქლოროპლასტები არის პლასტიდები, რომლებიც შეიცავს მწვანე პიგმენტს ქლოროფილს, რომელიც შთანთქავს სინათლის ენერგიას და იყენებს მას ნახშირორჟანგისა და წყლისგან ორგანული ნივთიერებების სინთეზისთვის. ქლოროპლასტები ციტოპლაზმიდან გამოყოფილია ორი მემბრანით, მრავალრიცხოვანი გამონაზარდები - გრანა შიდა მემბრანაზე, რომელშიც ქლოროფილის მოლეკულები და ფერმენტებია განთავსებული.

8. გოლჯის კომპლექსი არის ღრუების სისტემა, რომელიც გამოყოფილია ციტოპლაზმიდან მემბრანით. მათში ცილების, ცხიმებისა და ნახშირწყლების დაგროვება. მემბრანებზე ცხიმებისა და ნახშირწყლების სინთეზის განხორციელება.

9. ლიზოსომები ციტოპლაზმიდან ერთი მემბრანით შემოსაზღვრული სხეულებია. მათში შემავალი ფერმენტები აჩქარებს რთული მოლეკულების დაშლას მარტივ მოლეკულებად: ცილები ამინომჟავებად, რთული ნახშირწყლები მარტივებად, ლიპიდები გლიცეროლად და ცხიმოვან მჟავებად, ასევე ანადგურებს უჯრედის მკვდარ ნაწილებს და მთელ უჯრედებს.

10. ვაკუოლები - უჯრედის წვენით სავსე ღრუები ციტოპლაზმაში, სარეზერვო საკვები ნივთიერებებისა და მავნე ნივთიერებების დაგროვების ადგილი; ისინი არეგულირებენ წყლის შემცველობას უჯრედში.

11. ფიჭური ჩანართები - სარეზერვო ნუტრიენტების წვეთები და მარცვლები (ცილები, ცხიმები და ნახშირწყლები).

12. ბირთვი არის უჯრედის ძირითადი ნაწილი, რომელიც გარედან დაფარულია ორმემბრანიანი ბირთვული გარსით, რომელიც გაჟღენთილია ფორებით. ნივთიერებები შედიან ბირთვში და გამოიყოფა მისგან ფორების მეშვეობით. ქრომოსომა არის მემკვიდრეობითი ინფორმაციის მატარებელი ორგანიზმის მახასიათებლების, ბირთვის ძირითადი სტრუქტურების შესახებ, რომელთაგან თითოეული შედგება ერთი დნმ-ის მოლეკულისგან, რომელიც გაერთიანებულია ცილებთან. ბირთვი არის დნმ-ის, mRNA და rRNA სინთეზის ადგილი.