Centrifugiranje u citologiji. Zonsko centrifugiranje Frakcijsko stanično centrifugiranje

Leibig (Zig. prema S. Granik, 1962) utvrdio je da je u meristemskim tkivima željezo neophodno za sintezu enzima mitohondrija koji sadrže željezo; 82% ga je koncentrirano u kloroplastima; u jezgri su pronađeni samo tragovi. U isto vrijeme, A.F. Agafonova, N.S. Chaplygina (1962), proučavajući apsorpciju željeza u biljkama i njegovu raspodjelu unutar stanice, došao je do zaključka da stanične jezgre parenhima lišća kukuruza sadrže više željeza nego kloroplasti i strukture mitohondrijskog tipa. Sadržaj željeza u potonjem bio je niži nego u kloroplastima.
Rad J. Skoka (1962.) donosi neke podatke o lokalizaciji bora u staničnim strukturama. Autor ističe da mitohondriji i mikrosomi sadrže manje bora nego jezgre, plastidi i supernatant. Za obavljanje različitih staničnih funkcija koristi se bor koji se nalazi u dijaliziranoj frakciji supernatanta.
Mi smo zajedno sa Z.M. Klimovitskaya, L.D. Leydenskaya i E.V. Rudakova 1961.-1953. proučavao je lokalizaciju oligoelemenata mangana, molibdena i cinka u staničnoj strukturi biljaka, kao i sadržaj oligoelemenata u vezi s biljnom ontogenezom. Korištena je metoda diferencijalnog centrifugiranja koja omogućuje izolaciju citoplazme i organela stanice: jezgre, kloroplasta, mitohondrija. Slijedili smo metodu za izolaciju staničnih struktura koju je predložio N.S. Sissakyan, I.M. Mosolova (1961-1962).
Godine 1961. radilo se u rashladnoj centrifugi ukupne rezolucije 30 000 g. Veliki fragmenti stanica izolirani su iz homogenata listova šećerne repe (sorta Verkhnyachskaya 020) u 0,35 M otopini saharoze na 2500 g, kloroplasta na 4500 g i mitohondrija na 17 000 g. Odvojene frakcije su spaljene. U dobivenom pepelu određen je mangan. Njegov sadržaj je izražen u miligramima u smislu određene frakcije izolirane iz 1 kg sirove biljne tvari. Tako su veliki stanični fragmenti sadržavali 20,88 mg/kg mangana ili 44,5%; u kloroplastima - 3,46 ili 7,5; u mitohondrijima - 2,05, ili 4,3; u nezelenim citoplazmatskim strukturama - 20,43 mg/kg, odnosno 43,7%. Preparati kloroplasta identificirani su po njihovoj karakterističnoj luminiscenciji.
Najveća količina mangana bila je sadržana u nezelenim citoplazmatskim strukturama i velikim fragmentima stanica. Prilikom preračunavanja sadržaja mangana u pepelu svake frakcije, njegova najveća količina zabilježena je za frakciju kloroplasta i mitohondrija. Veliki stanični fragmenti sadržavali su 325,1 mg mangana na 100 g pepela ili 16,3 %; u kloroplastima - 823,9, ili 42,5; u mitohondrijima - 500, ili 25,1; u nezelenim citoplazmatskim strukturama - 321 mg, ili 16,1%, mangana.
Godine 1962. usvojili smo sljedeću metodologiju za proučavanje sadržaja mangana, molibdena i cinka u staničnoj strukturi listova graha i šećerne repe. Grah (sorta Herz-Freya) i šećerna repa (sorta Ramonskaya 04) uzgajane su na eksperimentalnoj farmi Instituta za fiziologiju bilja Akademije znanosti Ukrajinske SSR na livadno-černozemnom podzoliziranom tlu prema NPK pozadini s dodatak mangana, molibdena i cinka. Na početku, sredini i na kraju vegetacije uzeti su uzorci listova (30 g sirovine), zatim su mljeveni na ledu s 40 ml 0,5 M saharoze i 10 ml fosfatnog pufera (po Sørensenu); pH okoliša je 7,1. Dobiveni homogenati podvrgnuti su diferencijalnom centrifugiranju na centrifugi TM-14 rezolucije 20 000 g. Prvo su veliki fragmenti stanica uklonjeni iz homogenata. Zatim su manji fragmenti (fragmenti) stanica izolirani u centrifugi na 1500 i 3000 g tijekom 10 min. Uočeno je da su se jezgre pri 3000 g taložile unutar 10 minuta. Kloroplasti su izolirani 15 minuta na 6000 - 10 000 g, a mitohondriji su izolirani na 14 000 g. Izolirane frakcije podvrgnute su ponovljenom centrifugiranju s 2 ml saharoze 10-15 minuta odgovarajućom brzinom za svaku frakciju. Dobivene frakcije su spaljene u mufelu, au pepelu su određeni mangan, molibden i cink. Sadržaj ovih mikroelemenata određen je iu preostalom supernatantu.
Frakcije su podvrgnute histološkoj analizi. Pod mikroskopom su pregledane stanične membrane, jezgre i kloroplasti. Nismo uspjeli identificirati mitohondrije. Pokazalo se da listovi graha imaju vrlo teške oblikovane elemente; to su bili pretežno kloroplasti, koji su se gotovo potpuno istaložili na 3000-6000 g. Tekućina supernatanta bila je bistra. U šećernoj repi kloroplasti su se najbolje taložili pri 6000-10000 g. Nije bilo moguće dobiti potpuno proziran supernatant niti na 14 000 g. Ovo očito objašnjava nedostatak jedinstvene metode za izolaciju staničnih struktura. Različiti stupnjevi sedimentacije staničnih struktura zahtijevaju diferencirane metode za njihovu izolaciju, uzimajući u obzir biološke karakteristike svake kulture.
Količina mikroelemenata u staničnim strukturama izoliranih diferencijalnim centrifugiranjem izračunata je u miligramima na 1 kg sirovine uzorka, kao postotak ukupnog sadržaja i u miligramima na 100 g pepela svake frakcije.
Iz staničnih struktura lišća šećerne repe, maksimalna količina mangana (kada se računa po frakciji izoliranoj iz 1 kg sirovine) koncentrirana je u supernatantu, tj. u citoplazmi; u velikim staničnim fragmentima (kloroplasti, jezgre, mitohondriji) sadržan je u silaznom redoslijedu. Do sredine vegetacije povećava se količina mangana u lišću šećerne repe (tablica 45) zbog povećanja njegovog sadržaja u velikim staničnim fragmentima i supernatantu. U staničnim organelama (jezgre, kloroplasti, mitohondriji) ostaje prilično konstantan tijekom vegetacije.

Što je centrifugiranje? Za što se metoda koristi? Izraz "centrifugiranje" znači odvajanje tekućih ili čvrstih čestica tvari u različite frakcije pomoću centrifugalnih sila. Ovo odvajanje tvari provodi se pomoću posebnih uređaja - centrifuga. Koji je princip metode?

Princip centrifugiranja

Pogledajmo definiciju detaljnije. Centrifugiranje je djelovanje na tvari ultrabrzom rotacijom u specijaliziranom aparatu. Glavni dio svake centrifuge je rotor, koji sadrži gnijezda za ugradnju epruveta s materijalom koji je podložan odvajanju u zasebne frakcije. Kada se rotor okreće velikom brzinom, tvari koje se nalaze u epruvetama razdvajaju se u različite tvari prema razini gustoće. Na primjer, centrifugiranje uzoraka podzemne vode odvaja tekućinu i taloži krute čestice koje sadrži.

Autor metode

Po prvi put postalo je poznato što je centrifugiranje nakon eksperimenata koje je proveo znanstvenik A. F. Lebedev. Metodu je razvio istraživač za određivanje sastava vode u tlu. Prethodno je u te svrhe korišteno taloženje tekućine s naknadnim odvajanjem krutih uzoraka iz nje. Razvoj metode centrifugiranja omogućio je brže rješavanje ovog zadatka. Zahvaljujući ovom odvajanju, postalo je moguće ekstrahirati čvrsti dio tvari iz tekućine u suhom obliku u roku od nekoliko minuta.

Koraci centrifugiranja

Diferencijalno centrifugiranje započinje taloženjem tvari koje su predmet istraživanja. Ova obrada materijala odvija se u uređajima za taloženje. Tijekom taloženja dolazi do odvajanja čestica tvari pod utjecajem gravitacije. To vam omogućuje da pripremite tvari za bolje odvajanje pomoću centrifugalnih sila.

Zatim se tvari u epruvetama filtriraju. U ovoj fazi koriste se takozvani perforirani bubnjevi koji su namijenjeni za odvajanje tekućih čestica od krutih. Tijekom prezentiranih aktivnosti sav talog ostaje na stijenkama centrifuge.

Prednosti metode

U usporedbi s drugim metodama kojima je cilj odvajanje pojedinačnih tvari, poput filtracije ili sedimentacije, centrifugiranje omogućuje dobivanje sedimenta s minimalnim sadržajem vlage. Korištenje ove metode odvajanja omogućuje odvajanje finih suspenzija. Rezultat je proizvodnja čestica veličine 5-10 mikrona. Još jedna važna prednost centrifugiranja je mogućnost izvođenja pomoću opreme malih volumena i dimenzija. Jedini nedostatak metode je velika potrošnja energije uređaja.

Centrifugiranje u biologiji

U biologiji se rastavljanju tvari na pojedinačne tvari pribjegava kada je potrebno pripremiti preparate za ispitivanje pod mikroskopom. Centrifugiranje se ovdje provodi pomoću složenih uređaja - citorotora. Osim utora za epruvete, takvi uređaji opremljeni su držačima uzoraka i svim vrstama slajdova složenog dizajna. Dizajn centrifuge pri provođenju istraživanja u biologiji izravno utječe na kvalitetu dobivenih materijala i, sukladno tome, na količinu korisnih informacija koje se mogu izvući iz rezultata analize.

Centrifugiranje u industriji prerade nafte

Metoda centrifugiranja neizostavna je u proizvodnji ulja. Postoje ugljikovodični minerali iz kojih se tijekom destilacije voda ne oslobađa u potpunosti. Centrifugiranje omogućuje uklanjanje viška tekućine iz ulja, povećavajući njegovu kvalitetu. U ovom slučaju ulje se otopi u benzenu, zatim se zagrije na 60 o C, a zatim podvrgne centrifugalnoj sili. Na kraju izmjerite količinu preostale vode u tvari i po potrebi ponovite postupak.

Centrifugiranje krvi

Ova metoda se široko koristi u medicinske svrhe. U medicini vam omogućuje rješavanje sljedećeg broja problema:

Uzimanje pročišćenih uzoraka krvi za plazmaferezu. U tu svrhu formirani elementi krvi se odvajaju od plazme u centrifugi. Operacija omogućuje oslobađanje krvi od virusa, viška antitijela, patogenih bakterija i toksina.
Priprema krvi za transfuziju davatelja. Nakon što se tjelesna tekućina centrifugiranjem odvoji u zasebne frakcije, krvne stanice se vraćaju davatelju, a plazma se koristi za transfuziju ili zamrzava za kasniju upotrebu.
Izolacija trombocitne mase. Tvar se dobiva iz dobivene mase i koristi se u kirurškim i hematološkim odjelima medicinskih ustanova, u hitnoj terapiji i operacijskim dvoranama. Korištenje trombocitne mase u medicini omogućuje poboljšanje zgrušavanja krvi kod žrtava.
Sinteza crvenih krvnih stanica. Centrifugiranje krvnih stanica odvija se delikatnim odvajanjem njihovih frakcija prema posebnoj tehnici. Gotova masa, bogata crvenim krvnim stanicama, koristi se za transfuziju tijekom gubitka krvi i operacija. Crvena krvna zrnca često se koriste za liječenje anemije i drugih sustavnih bolesti krvi.

U suvremenoj medicinskoj praksi koriste se mnogi uređaji nove generacije koji omogućuju ubrzanje rotirajućeg bubnjića do određene brzine i zaustavljanje u određenom trenutku. To omogućuje preciznije razdvajanje krvi na crvene krvne stanice, trombocite, plazmu, serum i ugruške. Na sličan način se ispituju i druge tjelesne tekućine, posebno se odvajaju tvari u mokraći.

Centrifuge: glavne vrste

Shvatili smo što je centrifugiranje. Sada saznajmo koji se uređaji koriste za provedbu metode. Centrifuge mogu biti zatvorene i otvorene, na mehanički ili ručni pogon. Glavni radni dio ručnih otvorenih instrumenata je rotirajuća os smještena okomito. U njegovom gornjem dijelu nalazi se okomito učvršćena šipka na kojoj su smještene pomične metalne čahure. Sadrže posebne epruvete koje su pri dnu sužene. Na dnu rukava nalazi se vata, čime se izbjegava oštećenje staklene epruvete u kontaktu s metalom. Zatim se aparat pokreće. Nakon nekog vremena tekućina se odvaja od suspendiranih krutih tvari. Nakon toga ručna centrifuga se zaustavlja. Gusti, čvrsti sediment koncentriran je na dnu epruveta. Iznad njega je tekući dio tvari.

Mehaničke centrifuge zatvorenog tipa imaju veliki broj čahura za smještaj epruveta. Takvi uređaji su prikladniji u usporedbi s ručnim. Njihove rotore pokreću snažni elektromotori i mogu ubrzati do 3000 okretaja u minuti. To omogućuje bolje odvajanje tekućih tvari od krutih.

Značajke pripreme epruveta za centrifugiranje

Epruvete koje se koriste za centrifugiranje moraju biti napunjene ispitivanim materijalom jednake mase. Stoga se ovdje za mjerenja koriste posebne vage visoke preciznosti. Kada je potrebno uravnotežiti brojne epruvete u centrifugi, koristi se sljedeća tehnika. Nakon vaganja para staklenih posuda i postizanja iste mase, jedna od njih ostaje kao standard. Sljedeće epruvete se ekvilibriraju s ovim uzorkom prije nego što se stave u aparat. Ova tehnika značajno ubrzava rad kada je potrebno pripremiti cijeli niz epruveta za centrifugiranje.

Važno je napomenuti da se u epruvete nikada ne stavlja previše ispitivane tvari. Staklene posude se pune tako da razmak do ruba bude najmanje 10 mm. Inače će tvar istjecati iz epruvete pod utjecajem centrifugalne sile.

Supercentrifuge

Za odvajanje komponenti iznimno tankih suspenzija nije dovoljno koristiti konvencionalne ručne ili mehaničke centrifuge. U ovom slučaju potreban je impresivniji učinak centrifugalnih sila na tvari. Pri provedbi takvih procesa koriste se supercentrifuge.

Uređaji prikazanog plana opremljeni su slijepim bubnjem u obliku cijevi malog promjera - ne više od 240 mm. Duljina takvog bubnja značajno premašuje njegov presjek, što omogućuje značajno povećanje broja okretaja i stvaranje snažne centrifugalne sile.

U supercentrifugi tvar koja se ispituje ulazi u bubanj, kreće se kroz cijev i udara u posebne reflektore koji bacaju materijal na stijenke uređaja. Postoje i komore dizajnirane za odvojeno uklanjanje lakih i teških tekućina.

Prednosti supercentrifuga uključuju:

apsolutna nepropusnost;
najveći intenzitet odvajanja tvari;
kompaktne dimenzije;
sposobnost odvajanja tvari na molekularnoj razini.

Konačno

Tako smo saznali što je centrifugiranje. Trenutno, metoda nalazi svoju primjenu kada je potrebno izolirati precipitate iz otopina, pročistiti tekućine i odvojiti komponente biološki aktivnih i kemijskih tvari. Ultracentrifuge se koriste za razdvajanje tvari na molekularnoj razini. Metoda centrifugiranja aktivno se koristi u kemijskoj, naftnoj, nuklearnoj, prehrambenoj industriji, kao iu medicini.

Metoda smrzavanja

Temeljito nove mogućnosti za elektronsku mikroskopiju otvorile su se relativno nedavno, nakon razvoja metode "smrzavanje-cijepanje". Ovom metodom ispituju se najsitniji detalji strukture stanice, au transmisijskom elektronskom mikroskopu dobiva se trodimenzionalna slika.

Tijekom normalnog smrzavanja u stanicama se stvaraju kristali leda koji znatno narušavaju njihovu strukturu. Kako bi se to izbjeglo, stanice se vrlo brzo zamrznu na temperaturi tekućeg dušika (-196C). S takvim trenutnim smrzavanjem, kristali leda nemaju vremena za formiranje, a stanica ne doživljava deformaciju.

Smrznuti blok se cijepa oštricom noža (otuda i naziv metode). Zatim se, obično u vakuumskoj komori, višak leda uklanja sublimacijom. Ova operacija se naziva jetkanje. Nakon jetkanja, reljef u ravnini cijepa je jasnije definiran. Dobiveni uzorak se osjenča, odnosno rasprši se tanak sloj teških metala na površinu uzorka. No, trik je u tome što se taloženje izvodi pod kutom u odnosu na površinu uzorka. Ovo je vrlo važna točka. Pojavljuje se efekt sjene i slika izgleda trodimenzionalno.

U transmisijskom mikroskopu, snop elektrona može prodrijeti samo kroz vrlo tanke dijelove. Uobičajena debljina osjenčanih uzoraka je prevelika, tako da se organska tvar ispod metalnog sloja mora otopiti. Rezultat je tanka metalna replika (ili otisak) površine uzorka. Replika se koristi u prijenosnom mikroskopu.

Ova metoda pružila je, primjerice, jedinstvenu priliku za promatranje unutarnje strukture staničnih membrana.

Diferencijalno centrifugiranje

Osim mikroskopije, druga glavna i široko korištena metoda za proučavanje stanica je diferencijalno centrifugiranje ili frakcioniranje.

Princip metode je da se tijekom centrifugiranja razvija centrifugalna sila pod čijim utjecajem se suspendirane čestice talože na dno cijevi centrifuge.

Uvođenjem ultracentrifuge ranih 1940-ih, odvajanje staničnih komponenti postalo je izvedivo.

Prije podvrgavanja stanica centrifugiranju, potrebno ih je uništiti – mora se uništiti kruti okvir staničnih membrana. Za to se koriste različite metode: ultrazvučna vibracija, prešanje kroz male rupe ili najčešće mljevenje biljnih tkiva tučkom u porculanskom mužaru. Uz pažljivo korištenje metoda uništavanja, neke se organele mogu sačuvati netaknute.

Tijekom centrifugiranja velikom brzinom, velike stanične komponente (kao što su jezgre) brzo se talože (sedimentiraju) pri relativno malim brzinama i stvaraju sediment na dnu cijevi centrifuge. Pri većim brzinama talože se manje komponente poput kloroplasta i mitohondrija.

To jest, tijekom centrifugiranja, stanične komponente se raspadaju u frakcije: velike i male, zbog čega je drugi naziv metode? frakcioniranje. Štoviše, što su veća brzina i trajanje centrifugiranja, to je finija rezultirajuća frakcija.

Brzina sedimentacije (taloženja) komponenata izražava se pomoću koeficijenta taloženja, koji se označava S.

Faze diferencijalnog centrifugiranja: mala brzina (jezgre, citoskelet), srednja brzina (kloroplasti), velika brzina (mitohondriji, rizosomi, mikrotijela), vrlo velika brzina (ribosomi).

Frakcionirani stanični ekstrakti, koji se nazivaju i sustavi bez stanica, široko se koriste za proučavanje unutarstaničnih procesa. Samo radom s ekstraktima bez stanica može se utvrditi detaljan molekularni mehanizam bioloških procesa. Stoga je korištenje ove posebne metode donijelo trijumfalni uspjeh u proučavanju biosinteze proteina.

Pa, općenito, čiste frakcije unutarstaničnih struktura mogu se podvrgnuti bilo kojoj vrsti analize.

Metoda kulture stanica

Životinjske stanice izolirane u kulturi (odnosno stavljene na hranjivi medij) umiru nakon određenog broja dioba, pa se stoga smatraju teškim i nezgodnim objektom za uzgoj. Druga stvar su biljne stanice, koje se mogu dijeliti neograničen broj puta.

Metoda kulture stanica olakšava proučavanje mehanizama diferencijacije stanica u biljkama.

Na hranjivoj podlozi biljne stanice tvore homogenu nediferenciranu staničnu masu – kalus. Kalus se liječi hormonima. Pod utjecajem hormona iz kalusnih stanica mogu nastati različiti organi.

Metoda diferencijalnog centrifugiranja Metoda diferencijalnog centrifugiranja
centrifugiranje se koristi za
frakcioniranje stanica, tj. njihovo odvajanje
sadržaja u frakcije ovisno o specifičnim
težina raznih organela i staničnih inkluzija.
Kao rezultat centrifugiranja, komponente
stanice se talože iz otopine, talože
prema svojoj gustoći. Gušće
strukture se talože nižim stopama
centrifugiranje, a manje gusto - na visokoj
brzine

1. Metoda kojom se organele izoliraju iz stanica naziva se
frakcioniranje. Ova se metoda pokazala vrlo plodnom, dajući
biokemičari sposobnost izolacije različitih staničnih organela u
relativno čist oblik. Također vam omogućuje da odredite
kemijski sastav organela i enzima koje sadrže i
Na temelju dobivenih podataka zaključite o njihovim funkcijama u
kavez. Kao prvi korak, stanice se uništavaju
homogenizacija u nekom pogodnom mediju koji
osigurava sigurnost organela i sprječava njihovu agregaciju.
2. U sljedećoj fazi, stanični homogenat se podvrgava nizu
centrifugiranja, čija brzina i trajanje svaki put
povećava; taj se proces naziva diferencijalnim
centrifugiranje. Na dnu su taložene razne stanične organele
centrifugalne epruvete pri različitim brzinama centrifugiranja,
što ovisi o veličini, gustoći i obliku organela.

Faze diferencijalnog centrifugiranja:

3. Dobiveni talog se može sakupiti i
istraživanje. Takvi se najbrže rješavaju
velike i guste strukture, poput jezgri, i za
sedimentacija manjih i manje gustih
strukture kao što su mjehurići
endoplazmatski retikulum, potrebno
veće brzine i duže
vrijeme. Stoga, pri malim brzinama
centrifugiranjem, jezgre se talože i
ostale stanične organele ostaju unutra
suspenzije.

Faze diferencijalnog centrifugiranja:

4. Kod centrifugiranja prije svega i kada
Pri malim (1-3 tisuće g) ubrzanjima, jezgre će se smiriti i
nerazorene stanice će se smjestiti na 15-30 tisuća g
velike čestice, makrosomi, koji se sastoje od
mitohondriji, mali plastidi, peroksizomi, lizosomi
itd., na 50 tisuća g mikrosomi i fragmenti će se taložiti
vakuolarni sustav stanice.
Oborine se mogu ispitati pomoću
elektronski mikroskop za određivanje čistoće
dobivene frakcije. Sve frakcije do neke mjere
stupnjevi su kontaminirani drugim organelama. Ako je tako
ništa manje nije moguće postići dovoljnu čistoću
frakcije, zatim se podvrgavaju biokemijskoj obradi
analiza za određivanje kemijskog sastava i
enzimska aktivnost izoliranih organela.

Centrifugiranje s gradijentom gustoće

Nedavno je stvorena još jedna metoda
frakcioniranje stanica – centrifugiranje
u gradijentu gustoće; pri čemu
centrifugiranje se provodi u epruveti, u
koje su prethodno naslagane jedna na drugu
otopine saharoze rastućih koncentracija,
i, posljedično, povećanje gustoće. Na
centrifugiranje sadržano u homogenatu
organele se nalaze u epruveti centrifuge
na razinama na kojima se nalaze rješenja
saharoza koja im odgovara po gustoći.

Predavanje br.3.

Broj sati: 2

METODE PROUČAVANJA STANICE

1. Svjetlosna mikroskopija

2. Elektronska mikroskopija, strprednosti i nedostatci. Vrste elektronske mikroskopije

Stanice su vrlo male veličine, a istovremeno složene strukture. Stoga je za uspješno proučavanje građe i funkcioniranja stanice potrebno poznavati i vladati odgovarajućim eksperimentalnim metodama.

U prvoj fazi razvoja citologije jedini način proučavanja stanica bio je svjetlosna mikroskopija.

Mikroskopje uređaj koji omogućuje dobivanje uvećane slike malih predmeta koji nisu vidljivi golim okom. U mikroskopiji se obično koriste sljedeće jedinice duljine:

mikrometar (1 µm – 10 -6 m);

nanometar (1 nm – 10 -9 m);

angstrom (1Å – 10 -10 m).

Postoje svjetlosna i elektronska mikroskopija. Svjetlosni mikroskop koristi svjetlost za proizvodnju uvećane slike, dok elektronski mikroskop koristi struju elektrona. Kvaliteta slike određena je rezolucijom mikroskopa. Rezolucija je najmanja udaljenost na kojoj optika mikroskopa može zasebno razlikovati dvije blisko razmaknute točke. Rezolucija ljudsko oko ima oko 100 mikrona. To znači da golim okom, na udaljenosti od 25 cm, promatrač s prosječnom vidnom oštrinom može razlikovati jednu točku od druge ako su razmaknute najmanje 100 μm. Ako su dotične točke međusobno udaljene manje od 100 µm, čini se da su jedna mutna točka. Najbolji moderni svjetlosni mikroskop omogućuje ispitivanje struktura s razmakom između elemenata od oko 0,25 mikrona, elektronski mikroskop - oko 1,5 A.

Svjetlosna mikroskopija je skup metoda za promatranje mikroobjekata pomoću različitih optičkih mikroskopa. Ove metode bitno ovise o vrsti mikroskopske leće, njenim pomoćnim uređajima, vrsti mikroobjekta i načinu pripreme za promatranje, kao i o prirodi njegova osvjetljenja tijekom promatranja. Razlučivost svjetlosnog mikroskopa ograničena je dimenzijama usporedivim s valnom duljinom svjetlosti (0,4–0,7 μm za vidljivo svjetlo). Međutim, mnogi elementi stanične strukture mnogo su manji. Osim toga, kada se koristi konvencionalni svjetlosni mikroskop, većina struktura žive stanice je optički prazan. Optički prazne strukture su one koje su prozirne i gotovo se ne razlikuju po indeksu loma od okoline koja ih okružuje. Za prepoznavanje takvih struktura razvijene su različite metode. fiksacija I bojanje materijal.

Fiksacijaje tretman koji brzo prekida vitalne procese stanice i, koliko je to moguće, čuva strukturu stanica i tkiva nepromijenjenom. Nakon fiksacije stanice postaju propusne za boje, mjesto se fiksira i struktura makromolekula se stabilizira.

Bojanjekoristi se za optičku diferencijaciju staničnih struktura, kao iu citokemijskim studijama za identifikaciju lokalizacije kemijskih spojeva. Na primjer, bazične boje (hematoksilin) imaju afinitet prema sadržaju jezgre, dok kisele boje (eozin) boje citoplazmu. Koristi se za proučavanje živih stanica vitalne (doživotne) boje. Vitalne boje relativno lako prodiru u žive stanice i boje neke strukture ne oštećujući ih. Međutim, vitalne boje nisu potpuno bezopasne za stanicu, a nakon dulje izloženosti dovode do njezine smrti. Vitalne boje uključuju neutralna crvena(za bojenje citoplazme), metilensko modrilo(bojenje Golgijevog kompleksa), itd. Korištenjem vitalnih boja, bilo je moguće dokazati postojanje nekih staničnih organela, koje su prije pogrešno smatrane artefaktima.

Artefakt- promjena koja nastaje tijekom pripreme lijeka.

Prije testiranja stanice ili komadići tkiva obično se ulijevaju u rastaljeni parafin ili posebnu smolu. Medij koji se koristi za lijevanje je ohlađen ili polimeriziran. To rezultira čvrstim blokom, koji se reže na vrlo tanke dijelove pomoću mikrotoma. Obično je debljina sekcija za svjetlosnu mikroskopiju 1-10 µm. Nedostatak ove metode je oštećenje niza staničnih struktura. Stoga se koristi metoda pripreme odjeljaka pomoću brzog zamrzavanja. Zamrznuto tkivo reže se na posebnom mikrotomu (kriotomu) opremljenom hladnom komorom (kriostat).

Osim konvencionalne svjetlosne mikroskopije, stanice se proučavaju tamnopoljskom, faznokontrastnom, fluorescentnom i nekim drugim vrstama svjetlosne mikroskopije.

Mikroskopija tamnog polja. Za razliku od konvencionalnog mikroskopa, mikroskop za tamno polje opremljen je posebnim kondenzatorom. Kondenzator ima tamnu dijafragmu koja ne propušta svjetlost u središte vidnog polja, tako da je predmet osvijetljen kosim snopom. U ovom slučaju samo reflektirane i raspršene zrake od površine predmeta ulaze u leću mikroskopa, što povećava kontrast nekih struktura i čini ih vidljivima. Mikroskopija tamnog polja koristi se za promatranje brojnih struktura u živoj stanici. Konkretno, mikroskopija u tamnom polju koristi se za određivanje učestalosti oštećenja akrosoma u stanicama sperme domaćih životinja.

Fazno kontrastna mikroskopija. Fazno kontrastni mikroskop dizajnirao je Fritz Zernike 1932. godine. Fazno kontrastna mikroskopija izvrsna je metoda za intravitalno promatranje stanica. Koristi se za proučavanje mnogih staničnih organela i kromosoma tijekom diobe. Kondenzator fazno kontrastnog mikroskopa ima prstenastu dijafragmu kroz koju svjetlost prolazi u obliku šupljeg stošca, a preostale zrake se apsorbiraju. Objektiv sadrži faznu ploču, koja je prozirni disk s urezom. Oblik i veličina zareza odgovaraju izravnoj slici prstenaste dijafragme. Kada se predmet postavi između kondenzora i leće u stražnjoj žarišnoj ravnini leće, osim izravne slike pojavljuje se i nekoliko preklapajućih difrakcijskih slika otvora blende. Zarez fazne ploče izračunava se tako da se oba snopa zraka koji tvore izravnu i difrakcijsku sliku razlikuju duž optičkog puta za četvrtinu valne duljine. Tako se fazne razlike koje su prije bile nevidljive oku pretvaraju u razlike intenziteta i postaju vidljive.

Fluorescentna mikroskopija je dobra metoda za intravitalno promatranje stanica. Fluorescentni mikroskop omogućuje promatranje fluorescencije (sjaja) niza tvari i staničnih struktura. Fluorescenciju predmeta pobuđuju ultraljubičaste ili plavoljubičaste zrake iz posebnih izvora svjetlosti. Zračenje nekog objekta uvijek ima veću valnu duljinu od uzbudljive svjetlosti. Objekt se promatra u zrakama njegove fluorescencije, koje su pomoću svjetlosnih filtara odvojene od zraka uzbudljive svjetlosti. Brojne tvari (neki vitamini, pigmenti, lipidi) imaju vlastitu (primarnu) fluorescenciju. Stanične tvari koje nemaju ovo svojstvo prethodno su obojene posebnim bojama - fluorokromi, a zatim se opaža sekundarna fluorescencija.

Elektronska mikroskopija. Elektronski mikroskop koristi struju elektrona u vakuumu umjesto svjetlosti za stvaranje slike. Elektronska zraka nije fokusirana lećama, kao u svjetlosnom mikroskopu, već elektromagnetskim poljima. Slika se promatra na fluorescentnom ekranu i fotografira. Objekti tijekom elektronske mikroskopije nalaze se u dubokom vakuumu, pa se prvo podvrgavaju fiksaciji i posebnoj obradi. Iz tog razloga samo ubijene stanice mogu se proučavati pomoću elektronskog mikroskopa. Osim toga, moraju biti vrlo tanki, budući da tok elektrona snažno apsorbira objekt. U tom smislu, kao objekti se koriste ultratanki rezovi debljine 20-50 nm postavljeni na najtanje filmove. U prijenosni (transmisioni) elektronski mikroskop elektroni prolaze kroz objekt na isti način na koji svjetlost prolazi kroz njega u svjetlosnom mikroskopu. Transmisijska elektronska mikroskopija koristi se za proučavanje ultratankih presjeka mikroba, tkiva, kao i strukture malih objekata (virusi, flagele, itd.). U skenirajući elektronski mikroskop Precizno fokusiran snop elektrona kreće se naprijed-natrag po površini uzorka. U tom slučaju, elektroni koji se reflektiraju od njegove površine skupljaju se i tvore sliku. Prednost korištenja ove vrste elektronskog mikroskopa je u tome što stvara trodimenzionalnu sliku. Stoga se skenirajuća elektronska mikroskopija koristi za proučavanje površine predmeta. Elektronski mikroskop ima rezoluciju od oko 1-2 nm. To je dovoljno za proučavanje makromolekula.

Autoradiografija. Ova se metoda temelji na korištenju tvari obilježenih radioaktivnim izotopima. Ako se radioaktivni izotop doda mediju i apsorbira u stanicama tijekom metabolizma, njegova intracelularna lokalizacija može se naknadno otkriti pomoću autoradiografije. Ovom metodom tanki dijelovi stanica stavljaju se na film. Film potamni ispod onih mjesta gdje se nalaze radioaktivni izotopi. Fosfor se koristi kao izotopi ( P 32), željezo (Fe 59), sumpor (S 35 ), ugljik (C 14), tricij ( H 3 ) itd.

Centrifugiranje. Metoda je započela 1926. godine, kada je Svedberg izumio analitičku centrifugu i upotrijebio je za određivanje molekularne težine hemoglobina. Prije centrifugiranja potrebno je uništiti staničnu membranu. Uništavanje se provodi ultrazvučnom vibracijom, osmotskim šokom, mljevenjem i pritiskom kroz malu rupu. Uz pažljivo uništavanje, neke stanične organele ostaju netaknute. Usitnjena tkiva s uništenim staničnim membranama stavljaju se u epruvete i vrte u centrifugi velikom brzinom. Metoda se temelji na činjenici da različite stanične organele imaju različitu masu i gustoću. Gušće organele talože se u epruveti pri niskim brzinama centrifugiranja, manje gušće - pri velikim brzinama. Ovi se slojevi proučavaju zasebno. Stoga se jezgre i nerazorene stanice brzo talože pri relativno malim brzinama i stvaraju sediment na dnu cijevi centrifuge. Pri većim brzinama talože se mitohondriji, a pri još većim brzinama i dužim periodima centrifugiranja talože se ribosomi. Tipično, takve pročišćene komponente zadržavaju visoku biokemijsku aktivnost.

Metoda kulture stanica i tkiva sastoji se u tome što se iz jedne ili više stanica na posebnoj hranjivoj podlozi može dobiti skupina stanica iste vrste. Ova metoda ima goleme izglede ne samo za citologiju, već i za medicinu i poljoprivredu. Tako se stanične kulture koriste za razjašnjavanje obrazaca diferencijacije, interakcije stanica s okolinom, prilagodbe, starenja, transformacije itd. U biotehnologiji se stanične kulture koriste u proizvodnji cjepiva i biološki aktivnih tvari. U farmakologiji se koriste kao ispitni objekti pri ispitivanju novih lijekova. Utemeljitelj ove metode je američki zoolog i embriolog R. Garrison (1879.-1959.), koji je 1907. godine uspio uzgojiti stanice daždevnjaka u umjetnom okruženju izvan tijela. Nakon toga su uzgojene mnoge vrste biljnih i životinjskih stanica in vitro , a ova nam je metoda omogućila niz važnih otkrića u području stanične fiziologije. Izraz in vitro (latinski “u staklu”) znači da istraživanje nije provedeno na živom organizmu, već u staklenoj posudi ove ili one vrste. Za razliku od prvog izraza in vivo označava eksperiment s cijelim, živim organizmom. Kulture pripremljene izravno iz tjelesnih tkiva nazivaju se primarni usjevi. U većini slučajeva, stanice primarne kulture mogu se prenijeti iz posude za kulturu i koristiti za proizvodnju velikih količina sekundarni usjevi. Stanične linije mogu se koristiti za generiranje klonova koji su izvedeni iz jedne stanice progenitora. Može se učiniti spajanje stanica jedne ili više vrsta. Da bi se postigla fuzija, stanice se izlažu virusnim enzimima ili polietilen glikolu. Ove tvari oštećuju plazma membranu stanica, što rezultira stanicom s dvije odvojene jezgre. Nakon određenog vremena takva se stanica mitozom dijeli pri čemu nastaje hibridna stanica. U hibridnoj stanici svi su kromosomi spojeni u jednu veliku jezgru. Takve hibridne stanice mogu se klonirati za proizvodnju hibridne stanične linije. Koristeći ovu metodu, moguće je dobiti hibridne stanice čovjeka i miša, čovjeka i žabe krastače. Nastale hibridne stanice su nestabilne i nakon brojnih staničnih dioba gube većinu kromosoma bilo jednog ili drugog tipa. Konačni proizvod postaje, na primjer, u biti mišja stanica bez ili samo u tragovima prisutnih ljudskih gena. Stoga se ova tehnika može uspješno koristiti za mapiranje gena u ljudskim kromosomima.

Mikrokirurgija.Ova metoda se temelji na korištenju mikromanipulatora. To su uređaji koji omogućuju precizne pokrete mikroinstrumenata u kavezu. Mikro instrumenti se obično izrađuju od stakla. Njihov oblik određen je zadacima mikrokirurških operacija. Mogu biti u obliku igala, štrcaljki, pipeta, lopatica, skalpela itd. Pomoću mikromanipulatora mogu se izvoditi različiti zahvati na stanicama (injektiranje tvari u stanice, vađenje i presađivanje jezgri, lokalna oštećenja staničnih struktura i dr.). Mikrokirurški zahvati posebno dobro djeluju na velikim stanicama (jednostanične stanice, jajašca vodozemaca, embrionalne stanice nekih životinja). Tako se stanica amebe može podijeliti u tri glavne komponente - membranu, citoplazmu i jezgru. Te se komponente zatim mogu ponovno sastaviti u živu stanicu. Na taj način se mogu dobiti umjetne stanice koje se sastoje od komponenti različitih vrsta ameba. Mikrokirurški zahvati izvode se ne samo mikroinstrumentima, već i fokusiranim snopom ultraljubičastih zraka (beam micro-injection).

Osim gore navedenih metoda, za proučavanje stanica koriste se kromatografija, elektroforeza i neke druge. Nove metode napravile su golem napredak u proučavanju stanica. Međutim, treba imati na umu da klasične metode citologije, temeljene na fiksaciji, bojenju i proučavanju stanica pod svjetlosnim mikroskopom, još uvijek zadržavaju praktičnu važnost.

Predavanje 1.

Građa biljne stanice

Svjetlosna mikroskopija

Elektronska mikroskopija

Diferencijalno centrifugiranje

Metoda kulture stanica

Stanica je osnovna strukturna i funkcionalna jedinica živih organizama.

Stanice embrionalni(nespecijalizirana) tkiva životinja i biljaka općenito su po strukturi vrlo slična. Upravo je ta okolnost svojedobno bila povod za nastanak i razvoj stanične teorije. Morfološke razlike pojavljuju se već u diferenciranim stanicama specijaliziranih tkiva biljaka i životinja. Strukturne značajke biljne stanice, kao i biljke u cjelini, povezane su s načinom života i prehranom. Većina biljaka vodi relativno nepokretan (privezan) način života. Specifičnost ishrane biljaka je u tome što su voda i hranjiva, organska i anorganska, raspršena i biljka ih mora apsorbirati difuzijom. Osim toga, zelene biljke na svjetlu provode autotrofnu metodu prehrane. Zahvaljujući tome, razvile su se neke specifične značajke strukture i rasta biljnih stanica. To uključuje:

	izdržljiva polisaharid stanične stijenke, okružuje ćeliju i čini kruti okvir;
	plastidnog sustava , koji je nastao u vezi s autotrofnim tipom prehrane;
	vakuolarni sustav , koji je u zrelim stanicama obično predstavljen velikom središnjom vakuolom, koja zauzima do 95% volumena stanice i igra važnu ulogu u održavanju tlak turgora;
	posebna vrsta rasta stanica po uganuća(zbog povećanja volumena vakuole);
	totipotencija , odnosno mogućnost regeneracije kompletne biljke iz diferencirane biljne stanice;
	Postoji još jedan detalj koji razlikuje biljne stanice od životinjskih: u biljkama se tijekom stanične diobe ne izražavaju centriole.

Građa stanice u najopćenitijem obliku poznata vam je iz kolegija opće biologije, a pripremajući se za prijamni ispit dobro ste proučili ovu temu. O ovoj se temi također raspravlja u različitim aspektima u relevantnim sveučilišnim kolegijima (primjerice, zoologija beskralješnjaka, niže biljke). Osim toga, detaljnije upoznavanje sa stanicom na visokoj razini bit će na tečaju "citologija". Za nas je važno usredotočiti se na specifične strukturne značajke biljne stanice, uglavnom stanice više biljke.

Vrlo površno ispitivanje strukture tipične biljne stanice otkriva tri glavne komponente: (1) stanične stijenke, (2) vakuola, koja u zrelim stanicama zauzima središnji položaj i ispunjava gotovo cijeli njihov volumen i (3) protoplast, potisnut vakuolom na periferiju u obliku zidnog sloja. Upravo se te komponente otkrivaju pri malom povećanju svjetlosnog mikroskopa. Štoviše, stanična membrana i vakuola su proizvodi vitalne aktivnosti protoplasta.

Tijelo žive stanice? protoplast se sastoji od organela uronjenih u hijaloplazma. Stanični organizmi uključuju: jezgru, plastide, mitohondrije, diktiosome, endoplazmatski retikulum, mikrotijela itd. Hijaloplazma s organelama bez jezgre je citoplazma Stanice.

Za izražavanje veličine subcelularnih struktura koriste se određene mjere duljine: mikrometar I nanometar.

Mikrometar u SI sustavu mjernih jedinica je vrijednost jednaka 10 -6 m . Drugim riječima, mikrometar (skraćenica µm) je 1/1000000 metra i 1/1000 milimetra. 1 µm = 10-6 m . Stari naziv za ovu mjeru mikrona.

Nanometar u istom sustavu predstavlja milijunti dio milimetra 1 nm = 10 -9 m i tisućinka mikrometra.

Veličina i oblik biljnih stanica vrlo su različiti. Tipično, veličine stanica viših biljaka kreću se od 10 do 300 mikrona. Istina, postoje divovske stanice, na primjer, stanice sočne pulpe citrusnog voća promjera su nekoliko milimetara, ili iznimno duga lisna vlakna koprive dosežu 80 mm duljine s mikroskopskom debljinom.

Razlikuju se po obliku izodijametrijskićelije čije su linearne dimenzije u svim smjerovima jednake ili se malo razlikuju (odnosno, duljina, širina i visina tih ćelija su usporedive). Takve stanice nazivamo parenhimskim (parenhim).

Jako izdužene stanice, u kojima je duljina mnogo puta (ponekad stotine i tisuće) veća od visine i širine, nazivaju se prozenhimalne (prozenhim).

Metode proučavanja biljnih stanica

Razvijene su i korištene mnoge metode za proučavanje stanica, čije mogućnosti određuju razinu našeg znanja u ovom području. Napredak u proučavanju stanične biologije, uključujući najistaknutija postignuća posljednjih godina, obično je povezan s uporabom novih metoda. Stoga je za potpunije razumijevanje stanične biologije potrebno barem donekle poznavati odgovarajuće metode proučavanja stanica.

Svjetlosna mikroskopija

Najstarija i, ujedno, najčešća metoda proučavanja stanica je mikroskopija. Možemo reći da je početak proučavanja stanica položen izumom svjetlosnog optičkog mikroskopa.

Golo ljudsko oko ima razlučivost od oko 1/10 mm. To znači da ako pogledate dvije linije koje su međusobno udaljene manje od 0,1 mm, one se spajaju u jednu. Za razlikovanje struktura koje se nalaze bliže, koriste se optički instrumenti, poput mikroskopa.

No mogućnosti svjetlosnog mikroskopa nisu neograničene. Granica rezolucije svjetlosnog mikroskopa određena je valnom duljinom svjetlosti, odnosno optički mikroskop se može koristiti samo za proučavanje struktura čije su minimalne dimenzije usporedive s valnom duljinom svjetlosnog zračenja. Najbolji svjetlosni mikroskop ima snagu razlučivosti od oko 0,2 mikrona (ili 200 nm), što je oko 500 puta bolje od ljudskog oka. Teoretski je nemoguće napraviti svjetlosni mikroskop visoke rezolucije.

Mnoge komponente stanice slične su po svojoj optičkoj gustoći i, bez posebne obrade, praktički su nevidljive u konvencionalnom svjetlosnom mikroskopu. Kako bi ih učinili vidljivima, raznolikima bojila s određenom selektivnošću.

Početkom 19.st. Pojavila se potreba za bojama za bojanje tekstilnih tkanina, što je uzrokovalo ubrzani razvoj organske kemije. Ispostavilo se da neka od tih bojila boje i biološka tkiva te se, što je sasvim neočekivano, često preferirano vežu za određene komponente stanice. Korištenje takvih selektivnih boja omogućuje točnije proučavanje unutarnje strukture stanice. Evo samo nekoliko primjera:

	boja hematoksilin boji neke komponente jezgre plavo ili ljubičasto;
	nakon sekvencijalne obrade floroglucinol a zatim s solnom kiselinom lignificirane stanične membrane postaju trešnja crvene;
	boja Sudan III oboji suberizirane stanične membrane ružičasto;
	Slaba otopina joda u kalijevom jodidu oboji zrnca škroba u plavo.

Za mikroskopski pregled većine tkiva prije bojenja popraviti. Nakon fiksiranja, stanice postaju propusne za boje i stanična struktura se stabilizira. Jedan od najčešćih fiksativa u botanici je etilni alkohol.

Fiksacija i bojenje nisu jedini postupci koji se koriste za pripremu preparata. Većina tkiva je predebela da bi se odmah promatrala u visokoj rezoluciji. Stoga se izvode tanki dijelovi mikrotom. Ovaj uređaj koristi princip rezača kruha. Biljna tkiva zahtijevaju nešto deblje rezove nego životinjska tkiva jer su biljne stanice obično veće. Debljina presjeka biljnog tkiva za svjetlosnu mikroskopiju je oko 10 mikrona - 20 mikrona. Neka su tkiva premekana da bi se odmah rezala. Stoga se nakon fiksacije ulijevaju u rastaljeni parafin ili posebnu smolu, koja zasiti cijelu tkaninu. Nakon hlađenja nastaje čvrsti blok koji se reže pomoću mikrotoma. Istina, punjenje se mnogo rjeđe koristi za biljna tkiva nego za životinjska. To se objašnjava činjenicom da biljne stanice imaju jake stanične stijenke koje čine okvir tkiva. Lignificirane ljuske su posebno jake.

Međutim, polijevanje može poremetiti strukturu stanice, pa se koristi druga metoda gdje se ta opasnost smanjuje? brzo zamrzavanje. Ovdje možete učiniti bez popravljanja i punjenja. Smrznuto tkivo reže se posebnim mikrotomom (kriotom).

Smrznuti dijelovi pripremljeni na ovaj način imaju jasnu prednost boljeg očuvanja prirodnih strukturnih značajki. Međutim, teže ih je kuhati, a prisutnost kristala leda ipak kvari neke detalje.

Mikroskopisti su uvijek bili zabrinuti zbog mogućnosti gubitka i izobličenja nekih staničnih komponenti tijekom procesa fiksacije i bojenja. Stoga se dobiveni rezultati verificiraju drugim metodama.

Mogućnost proučavanja živih stanica pod mikroskopom činila se vrlo primamljivom, ali na način da se jasnije vide detalji njihove strukture. Ovu priliku pružaju posebni optički sustavi: fazni kontrast I smetnje mikroskopi. Dobro je poznato da svjetlosni valovi, poput vodenih valova, mogu interferirati jedni s drugima, povećavajući ili smanjujući amplitudu rezultirajućih valova. U konvencionalnom mikroskopu, dok svjetlosni valovi prolaze kroz pojedinačne komponente stanice, mijenjaju svoju fazu, iako ljudsko oko ne može otkriti te razlike. Ali zbog interferencije, valovi se mogu pretvoriti, a zatim se različite komponente stanice mogu razlikovati jedna od druge pod mikroskopom, bez pribjegavanja bojanju. Ovi mikroskopi koriste 2 zrake svjetlosnih valova koje međusobno djeluju (superponiraju) jedna na drugu, povećavajući ili smanjujući amplitudu valova koji ulaze u oko iz različitih komponenti stanice.

Elektronska mikroskopija

Mogućnosti svjetlosnog mikroskopa, kao što je već spomenuto, ograničene su valnom duljinom vidljive svjetlosti. Njegova najveća razlučivost je otprilike 0,2 mikrona.

Veliki napredak u mikroskopiji postignut je 1920-ih kada je otkriveno da se prikladno odabrana elektromagnetska polja mogu koristiti poput leća za fokusiranje elektronskih zraka.

Valna duljina elektrona puno je kraća od valne duljine vidljive svjetlosti, a ako se umjesto svjetlosti koriste elektroni, granica razlučivosti mikroskopa može se znatno smanjiti.

Na temelju svega toga nastao je mikroskop u kojem se umjesto svjetlosti koristi snop elektrona. Prvi elektronski mikroskop konstruirali su 1931. Knoll i Ruska u Njemačkoj. Međutim, prošlo je mnogo godina prije nego što je postalo moguće proučavati dijelove tkiva pomoću ovog mikroskopa. Tek 50-ih godina razvijene su metode za proizvodnju profila s potrebnim kvalitetama. Od tog vremena započela je nova era mikroskopije, a tok informacija o finoj strukturi stanica doslovno se izlio u znanost. (ultrastruktura stanica).

Poteškoće elektronske mikroskopije su u tome što je za proučavanje bioloških uzoraka potrebna posebna obrada preparata.

Prva poteškoća je u tome što elektroni imaju vrlo ograničenu moć prodora, pa se moraju pripremiti ultratanki presjeci debljine 50 - 100 nm. Da bi se dobili tako tanki dijelovi, tkivo se najprije impregnira smolom: smola polimerizira u obliku tvrdog plastičnog bloka. Zatim se oštrim staklenim ili dijamantnim nožem režu rezovi na posebnom mikrotomu.

Postoji još jedna poteškoća: kada elektroni prolaze kroz biološko tkivo, ne dobiva se kontrastna slika. Da bi se dobio kontrast, tanke sekcije bioloških uzoraka impregniraju se solima teških metala.

Postoje dvije glavne vrste elektronskih mikroskopa. U prijenos(transmisijskog) mikroskopa, snop elektrona, prolazeći kroz posebno pripremljen uzorak, ostavlja svoju sliku na ekranu. Razlučivost modernog prijenosnog elektronskog mikroskopa gotovo je 400 puta veća od svjetlosne. Ovi mikroskopi imaju rezoluciju od oko 0,5 nm (za usporedbu, promjer atoma vodika je oko 0,1 nm).

Unatoč tako visokoj rezoluciji, prijenosni elektronski mikroskopi imaju velike nedostatke:

Trodimenzionalna (volumetrijska) slika dobiva se pomoću skeniranje elektronski mikroskop (EM). Ovdje zraka ne prolazi kroz uzorak, već se odbija od njegove površine.

Je li ispitni uzorak fiksiran i osušen, a zatim prekriven tankim slojem metala? operacija se zove sjenčanje(uzorak je osjenčan).

Kod skeniranja EM, fokusirana elektronska zraka usmjerava se na uzorak (uzorak se skenira). Kao rezultat, metalna površina uzorka emitira sekundarne elektrone niske energije. Oni se snimaju i pretvaraju u sliku na televizijskom ekranu. Maksimalna rezolucija skenirajućeg mikroskopa je mala, oko 10 nm, ali je slika trodimenzionalna.

Metoda smrzavanja

Temeljito nove mogućnosti elektronske mikroskopije otvorile su se relativno nedavno, nakon razvoja metode "smrzavanje - čipiranje". Ovom metodom ispituju se najsitniji detalji strukture stanice, au transmisijskom elektronskom mikroskopu dobiva se trodimenzionalna slika.

Tijekom normalnog smrzavanja u stanicama se stvaraju kristali leda koji znatno narušavaju njihovu strukturu. Kako bi se to izbjeglo, stanice se vrlo brzo zamrznu na temperaturi tekućeg dušika (- 196 C). S takvim trenutnim smrzavanjem, kristali leda nemaju vremena za formiranje, a stanica ne doživljava deformaciju.

Smrznuti blok se cijepa oštricom noža (otuda i naziv metode). Zatim se, obično u vakuumskoj komori, višak leda uklanja sublimacijom. Ova operacija se zove jetkanje. Nakon jetkanja, reljef u ravnini cijepa je jasnije definiran. Primljeni uzorak zasjenjen, odnosno tanak sloj teških metala raspršuje se na površinu uzorka. No, trik je u tome što se taloženje izvodi pod kutom u odnosu na površinu uzorka. Ovo je vrlo važna točka. Pojavljuje se efekt sjene i slika izgleda trodimenzionalno.

U transmisijskom mikroskopu, snop elektrona može prodrijeti samo kroz vrlo tanke dijelove. Uobičajena debljina osjenčanih uzoraka je prevelika, tako da se organska tvar ispod metalnog sloja mora otopiti. Rezultat je tanak metal replika(ili otisak) s površine uzorka. Replika se koristi u prijenosnom mikroskopu.

Ova metoda pružila je, primjerice, jedinstvenu priliku za promatranje unutarnje strukture staničnih membrana.

Diferencijalno centrifugiranje

Osim mikroskopije, druga glavna i raširena metoda proučavanja stanica je diferencijalno centrifugiranje ili frakcioniranje.

Princip metode je da se tijekom centrifugiranja razvija centrifugalna sila pod čijim utjecajem se suspendirane čestice talože na dno cijevi centrifuge.

Uvođenjem ultracentrifuge ranih 1940-ih, odvajanje staničnih komponenti postalo je izvedivo.

Brzina sedimentacije (taloženja) komponenti izražava se pomoću koeficijent sedimentacije, naznačeno S.

Faze diferencijalnog centrifugiranja: mala brzina (jezgre, citoskelet), srednja brzina (kloroplasti), velika brzina (mitohondriji, rizosomi, mikrotijela), vrlo velika brzina (ribosomi).

Pa, općenito, čiste frakcije unutarstaničnih struktura mogu se podvrgnuti bilo kojoj vrsti analize.

Metoda kulture stanica

Metoda kulture stanica olakšava proučavanje mehanizama diferencijacije stanica u biljkama.

Tvore li biljne stanice na hranjivoj podlozi homogenu nediferenciranu staničnu masu? žulj. Kalus se liječi hormonima. Pod utjecajem hormona iz kalusnih stanica mogu nastati različiti organi.

Građa i funkcioniranje biljne stanice.

1. Građa biljne stanice: celulozna membrana, plazma membrana, citoplazma s organelama, jezgra, vakuole sa staničnim sokom. Prisutnost plastida glavno je obilježje biljne stanice.

2. Funkcije stanične membrane – daje stanici oblik, štiti je od čimbenika okoline.

3. Plazma membrana je tanki film, sastoji se od međusobno povezanih molekula lipida i proteina, odvaja unutarnji sadržaj od vanjskog okoliša, osigurava transport vode, minerala i organskih tvari u stanicu osmozom i aktivnim transportom, a također uklanja štetne otpadne proizvode.

4. Citoplazma je unutarnja polutekuća sredina stanice u kojoj se nalaze jezgra i organele, osigurava međusobnu povezanost te sudjeluje u osnovnim životnim procesima.

5. Endoplazmatski retikulum – mreža razgranatih kanala u citoplazmi. Sudjeluje u sintezi proteina, lipida i ugljikohidrata te u transportu tvari. Ribosomi su tijela smještena na ER ili u citoplazmi, sastoje se od RNA i proteina, a uključeni su u sintezu proteina. EPS i ribosomi su jedinstveni aparat za sintezu i transport proteina.

6. Mitohondriji su organele koje od citoplazme dijele dvije membrane. U njima se, uz sudjelovanje enzima, oksidiraju organske tvari i sintetiziraju molekule ATP-a. Povećanje površine unutarnje membrane na kojoj se nalaze enzimi zbog krista. ATP je energetski bogata organska tvar.

7. Plastidi (kloroplasti, leukoplasti, kromoplasti), njihov sadržaj u stanici glavno je obilježje biljnog organizma. Kloroplasti su plastidi koji sadrže zeleni pigment klorofil, koji apsorbira svjetlosnu energiju i koristi je za sintezu organskih tvari iz ugljičnog dioksida i vode. Kloroplasti su od citoplazme odvojeni dvjema membranama, brojnim izraštajima – granama na unutarnjoj membrani, u kojima su smještene molekule klorofila i enzimi.

8. Golgijev kompleks je sustav šupljina odijeljenih od citoplazme membranom. Akumulacija proteina, masti i ugljikohidrata u njima. Izvođenje sinteze masti i ugljikohidrata na membranama.

9. Lizosomi su tjelešca odvojena od citoplazme jednom membranom. Enzimi koje sadrže ubrzavaju razgradnju složenih molekula na jednostavne: proteina na aminokiseline, složenih ugljikohidrata na jednostavne, lipida na glicerol i masne kiseline, a također uništavaju mrtve dijelove stanice i cijele stanice.

10. Vakuole - šupljine u citoplazmi ispunjene staničnim sokom, mjesto nakupljanja rezervnih hranjivih i štetnih tvari; reguliraju sadržaj vode u stanici.

11. Stanične inkluzije - kapljice i zrnca rezervnih hranjivih tvari (proteini, masti i ugljikohidrati).

12. Jezgra je glavni dio stanice, izvana prekriven dvomembranskom jezgrinom membranom prožetom porama. Tvari ulaze u jezgru i uklanjaju se iz nje kroz pore. Kromosomi su nositelji nasljednih informacija o karakteristikama organizma, glavnim strukturama jezgre, od kojih se svaki sastoji od jedne molekule DNA u kombinaciji s proteinima. Jezgra je mjesto sinteze DNA, mRNA i rRNA.